直彥亮，林思薪，賀 憲，張 震

（1.廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院，廣東廣州 511400；2.深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東深圳 518104）

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS) 是發(fā)病率較高的一類自身免疫性疾病，主要導(dǎo)致脊柱和關(guān)節(jié)化強(qiáng)直[1]，是AS 患者殘疾的主要病理因素。目前臨床上對(duì)AS常采用非甾體抗炎藥和生物制劑進(jìn)行治療[2]。依那西普(Etanercept)是一類腫瘤壞死因子拮抗劑，通過(guò)拮抗TNF-α 表達(dá)，抑制炎癥，起到治療AS 的作用[3]。研究表明微小RNA(MicroRNA，miRNA)在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，調(diào)控骨形成、骨吸收和骨重塑等過(guò)程[4]。Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路在成骨過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)成骨細(xì)胞生成的主要通路。OPG/ RANKL/ RANK信號(hào)通路是細(xì)胞調(diào)節(jié)骨代謝平衡的關(guān)鍵系統(tǒng)[5]。RANKL 與RANK 結(jié)合后，激活RANK 和NF-κB，進(jìn)而引發(fā)破骨細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成分化成熟。而OPG 在破骨細(xì)胞外與RANKL 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，使RANK 失活，抑制破骨細(xì)胞分化和破骨細(xì)胞活性，阻礙骨吸收[6]。OPG、RANKL、RANK 三者相互作用，共同構(gòu)成了調(diào)節(jié)骨代謝平衡的OPG/RANKL/RANK 系統(tǒng)。miR-146a 可以抑制炎癥發(fā)生，并且可能成為AS的一種診斷生物學(xué)標(biāo)志[7]。而依那西普是否與miR-146a存在關(guān)系，以及miR-146a對(duì)骨代謝以及Wnt/βcatenin、OPG/RANKL/RANK 信號(hào)通路是否有影響，均未有相關(guān)研究報(bào)道。本研究擬通過(guò)研究依那西普對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎小鼠miR-146a 表達(dá)的影響，以及依那西普和miR-146a對(duì)炎癥因子、骨代謝的影響，為深入了解依那西普生物學(xué)機(jī)制及治療靶點(diǎn)提供支持。

1 研究對(duì)象及材料

1.1 研究對(duì)象

以56 例AS 活動(dòng)期患者與45 只鼠齡4～5 周的雄性健康BALB/c 小鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）作為研究對(duì)象。

AS 活動(dòng)期患者選自2017 年1 月-2018 年12 月期間在廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院住院診治的病例，其中男30例，女26例，年齡21～67歲，平均41.24±10.4歲；病程0.3～30 年，平均14.27±7.72 年。采用隨機(jī)數(shù)字表法將56 例AS 患者分為依那西普組和柳氮磺吡啶(sulfasalazine，SASP) 組，各28 例，2 組患者在年齡、病程等方面差異均無(wú)明顯區(qū)別，具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①?gòu)?qiáng)直性脊柱炎評(píng)估組織(Assessment of in Ankylosing Spondylitis，ASAS)發(fā)布的中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎(axial spondyloarthritis，SpA) 分類標(biāo)準(zhǔn)[8]；②入組前接受化學(xué)藥物或生物藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠、哺乳期和近期計(jì)劃受孕患者；②嚴(yán)重關(guān)節(jié)畸形疾病；③有嚴(yán)重肝腎功能障礙者。所有研究對(duì)象簽署知情同意書并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后執(zhí)行。

1.2 主要試劑及儀器

酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、總RNA提取試劑（Invitrogen 公司）；蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、兔抗鼠酶標(biāo)二抗（碧云天生物）；鼠抗人單克隆抗體Wnt、β-catenin、RANKL、RANK、OPG（CST 公司）；lipofectamine 2000試劑盒（Invitrogen 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqMan@MicroRNA Assays Realtime PCR 試劑盒（大連寶生物公司）；miR-146a、U6 引物（上海生工生物）。Applied Biosystems 7500儀器、Bio-Rad凝膠成像分析儀（美國(guó)伯樂(lè)）；全自動(dòng)血液分析儀（邁瑞醫(yī)療）。

1.3 研究方法

1.3.1 對(duì)患者的治療方法以及相關(guān)檢測(cè)

治療方法：依那西普組給予依那西普(輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：506005，規(guī)格：25 mg)皮下注射，25 mg/次，每周2 次，治療3 月；SASP 組服用SASP(上海三維制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020450，批號(hào)：20140420，規(guī)格：0.25 g/片)，4片/次，2次/d，治療3月。

RT-qPCR 檢測(cè)：Trizol 法提取血清RNA。用Taq-Man@MicroRNA Reverse Transcription kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)總體系為10 μL。用TaqMan@MicroRNA Assays Realtime PCR 試劑盒檢測(cè)miR-146a 表達(dá)，以U6作為內(nèi)標(biāo)，miR-146a 上游引物5′-CAGCTGCATTGGATTTACAA-3′;下游引物5′-GCCTGAGACTCTGCCTTCTG -3′；U6 上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，70bp；下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，94bp。SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒檢測(cè)FOXO1 mRNA 表達(dá)，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，根據(jù)△△CT 法對(duì)結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析，根據(jù)各樣本的平均CT 值，以2-ΔΔCt 表示mRNA 相對(duì)表達(dá)水平，所有反應(yīng)均在ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀完成。

1.3.2 動(dòng)物造模、處理及分組

45 只4～5 周的雄性健康BALB/c 小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行造模(蛋白聚糖+弗氏佐劑造模)，造模成功表現(xiàn)為四肢足趾部紅腫[9]。將造模后的小鼠分為5組：①模型對(duì)照組；②依那西普組，劑量0.5 mg/kg[10]，每天1 次；③miR-146a 抑制劑組，劑量80 mg/kg，每天1次（參考瑞博動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用量說(shuō)明）；④依那西普+miR-146a 抑制劑組，同時(shí)給予依那西普0.5 mg/kg，miR-146a 抑制劑80 mg/kg，每天1 次；⑤Negtive Con組（miR-146a 抑制劑陰性對(duì)照組），給予無(wú)序miRNA80 mg/kg，每天1 次。每組9只，均為尾靜脈注射。治療4周后處死，獲得血液和脊柱組織。

1.3.3 對(duì)小鼠相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

檢測(cè)指標(biāo)：全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)小鼠CRP，雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（ABC-ELISA）法檢測(cè)TNFα、IL-6、PTH、OPG、BALP、OC。

Western blot：參照王簕等[11]對(duì)骨組織總蛋白的提取方法，將小鼠脊柱剪碎后，用錘擊加研磨法處理脊柱組織后，根據(jù)蛋白提取試劑盒說(shuō)明提取小鼠脊柱組織總蛋白。BCA 試劑盒說(shuō)明檢測(cè)總蛋白量。根據(jù)目的蛋白分子量用合適濃度的SDS-PAGE 凝膠電泳分離，繼而轉(zhuǎn)膜和封閉，孵育一抗和二抗后，化學(xué)發(fā)光后進(jìn)行采集圖像。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組患者miR-146a表達(dá)水平

通過(guò)熒光定量PCR 檢測(cè)2 組患者血清miR-146a表達(dá)水平，結(jié)果顯示，依那西普與SASP 治療后2組患者血清miR-146a 表達(dá)水平明顯下調(diào)，但依那西普治療后更明顯，差異具有顯著性意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 依那西普與SASP治療后對(duì)患者血清miR-146a表達(dá)水平的影響

2.2 miR-146a 轉(zhuǎn)染對(duì)模型炎癥因子及骨代謝生化指標(biāo)影響

將miR-146a抑制劑注射至小鼠模型。觀察炎癥因子和骨代謝生化指標(biāo)變化，結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組及Negative Con 組相比，依那西普、miR-146a 抑制劑顯著降低炎癥因子TNF-α，IL-6，CRP 和骨代謝指標(biāo)BALP 血清水平，提高骨代謝生化指標(biāo)OPG、OC、PTH 血清水平，且miR-146a 抑制劑+依那西普改善更為顯著，與miR-146a 抑制劑組、依那西普組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見表1。

表1 炎癥因子和骨代謝生化指標(biāo)

2.3 miR-146a轉(zhuǎn)染對(duì)成骨通路和破骨通路蛋白影響

與Negative Con 組比，依那西普、miR-146a 抑制劑以及miR-146a 抑制劑+依那西普組均顯著下調(diào)RANKL、RANK 蛋白表達(dá)，上調(diào)OPG、Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)。見圖2。

圖2 蛋白表達(dá)變化

3 討論

SA、SP 是治療AS 的傳統(tǒng)藥物，通過(guò)其代謝產(chǎn)物水楊酸起到抗炎作用。近年來(lái)，依那西普廣泛用于強(qiáng)直性脊柱炎治療，因其能抑制炎癥進(jìn)程，緩解局部疼痛癥狀從而改善患者生活質(zhì)量。在強(qiáng)直性脊柱炎患者中多種miRNA 分子異常表達(dá)，其機(jī)制之一是參與成骨、破骨及炎癥過(guò)程[12]。

本研究首先發(fā)現(xiàn)依那西普組治療后能顯著降低miR-146a 表達(dá)水平，與對(duì)照組在明顯差異(P＜0.05)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)依那西普和miR-146a抑制劑可以顯著降低小鼠血清炎癥因子TNF-α，IL-6，CRP 和骨代謝指標(biāo)BALP 血清水平，提高骨代謝生化指標(biāo)OPG、OC、PTH 血清水平，兩者聯(lián)合效果更為顯著，推測(cè)依那西普可能是通過(guò)抑制miR-146a 表達(dá)，使得治療效果疊加從而改善小鼠病情。后續(xù)的研究證明依那西普和miR-146a 抑制劑治療后可促進(jìn)成骨生成的Wnt、β-catenin 蛋白表達(dá)上調(diào)、抑制破骨細(xì)胞生成的OPG 蛋白上調(diào)，而促進(jìn)破骨細(xì)胞生成的RANKL、RANK 破骨通路下調(diào)，差異具有顯著性意義。上述結(jié)果表明伊那西普改善活動(dòng)期AS患者的炎癥反應(yīng)和骨代謝的機(jī)制是通過(guò)miR-146a介導(dǎo)。依那西普可下調(diào)miR-146a 表達(dá)，這種調(diào)節(jié)作用可能通過(guò)促進(jìn)成骨和抑制破骨，從而改善患者炎癥因子和骨代謝。本研究為全面了解依那西普的治療作用以及針對(duì)miR 分子開發(fā)潛在治療手段提供支持。

綜上所述，依那西普通過(guò)抑制強(qiáng)直性脊柱炎患者miR-146a 表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)促進(jìn)調(diào)節(jié)成骨作用并抑制破骨等過(guò)程，從而改善患者炎癥因子及骨代謝。在AS患者中有諸多miRNA 分子異常表達(dá)，本研究只研究了一種，不清楚依那西普對(duì)其它miRNA 的調(diào)節(jié)作用，在后續(xù)的研究中需要深入了解依那西普對(duì)其它miRNA的表達(dá)調(diào)控。