李曉娜，田慧勇，楊曉夏*，曹濤，李森

（1.深圳市通量檢測科技有限公司，廣東 深圳 518102；2.廣東省檢迅檢測科技有限公司，廣東 東莞 523843；3.深圳市匯知科技有限公司，廣東 深圳 518101）

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是黃曲霉、寄生曲霉和野曲霉等真菌產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物[1]。在結(jié)構(gòu)上AFs在紫外光下發(fā)出熒光的顏色不同，是二呋喃香豆素的衍生物[2]。根據(jù)熒光的顏色AFs分為黃曲霉毒素B1和B2（AFT B1，AFT B2）（圖1-1），G1和 G2（AFT G1，AFT G2）[3，4]。黃曲霉毒素M1和M2（AFT M1，AFT M2）在牛奶中存在，是AFT B1和AFT B2的代謝產(chǎn)物；AFT B1的另一類代謝產(chǎn)物是黃曲霉毒素Q1（AFT Q1）和黃曲霉毒素醇[5]。黃曲霉毒素對易感實(shí)驗(yàn)動物和家畜具有顯著的毒性和致癌性，對人體具有急性毒性和慢性肝癌效應(yīng)，是目前研究最為深入的真菌毒素類群，是一級致癌物[6]。

圖1 -1 AFT B1、AFT B2的結(jié)構(gòu)圖

不同國家對AFT B1的設(shè)定范圍不同，基本也都在1～20 μg·kg-1之間[7]。歐盟法規(guī)規(guī)定：谷物中AFT B1含量最大值為2 μg·kg-1，其衍生品的最高限量為4 μg·kg-1，嬰兒食品最為嚴(yán)格，為 0.1μg·kg-1[8，9]。中國標(biāo)準(zhǔn) GB 2761-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中規(guī)定，大米中AFT B1最高限量為10μg·kg-1[10]。大米由于運(yùn)輸或存儲不當(dāng)易滋生霉菌從而產(chǎn)生霉菌毒素[11]。

供給深圳的大米主要來自黑龍江五常、遼寧燈塔及全國各地等優(yōu)質(zhì)原糧基地，在東北、安徽等多個優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)設(shè)立示范田，同時還包括廣西巴馬等對口幫扶等地區(qū)，大米完成加工后將被端上2000多萬深圳人的餐桌。供給大米要從生產(chǎn)基地、水土環(huán)境、生產(chǎn)過程、可追溯以及產(chǎn)品質(zhì)量五大因素考量，還要經(jīng)過石機(jī)清理雜質(zhì)，拋光過篩，色選機(jī)等多項(xiàng)工序。品控人員要對加工后的大米進(jìn)行7道工序的4次檢測，將重金屬、水分含量等控制在標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)，最終經(jīng)過嚴(yán)格評價滿足供深食品標(biāo)準(zhǔn)體系要求，才能被端上深圳市民的餐桌。本研究對深圳特區(qū)抽樣的大米進(jìn)行檢測，通過對不同年度和不同抽樣場所的大米中AFT B1含量綜合分析，客觀地分析評價深圳特區(qū)大米中AFT B1含量總體情況。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

政府部門委托抽樣送檢，抽樣情況見表1。

表1 2018～2020年深圳特區(qū)大米抽樣情況

1.2 主要儀器和試劑

高效液相色譜儀，型號：e2695，購自Waters公司；熒光檢測器，型號：FLD-3400 RS，購自Thermofisher公司；C18色譜柱，型號：Syncronis C18 250 mm×4.6 mm×5 μm，購自Thermofisher公司；AflaCLEANTM黃曲霉總量免疫親和柱（體積：3 mL），型號：10514，購自德國LCTech公司。

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、正己烷（色譜純）、三氟乙酸（析純）、碳酸鈉（分析純）、碳酸氫鈉（分析純）均購自阿拉丁公司。AFT B1標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：162658、純度≥98%）購自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司。本試驗(yàn)用水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

1.3 檢測方法

1.3.1 樣品前處理

(1)大米：高速粉碎機(jī)將其粉碎，過粒徑小于2 mm孔徑的試驗(yàn)篩，混均勻縮分每袋10 g，密封保存。

(2)樣品提?。悍Q取大米5 g試樣（精確至0.01 g），置于50 mL離心管，加入20.0 mL乙腈-水溶液（體積比84∶16），渦旋混勻，置于搖床振蕩20 min，在600 r / min離心10 min，取上清液備用。

(3)樣品AFT 固相凈化柱凈化。

(4)凈化柱平衡：將凈化柱于室溫中放置15 min以上，平衡至室溫。

(5)過柱：取5～50 mL的樣品提取稀釋液上AflaCLEANTM凈化柱，在過柱中可以對凈化柱進(jìn)行加壓或抽真空，但必需保證柱流速1～2滴/秒。該凈化柱最大上樣量以AFT B1計為150 ng。

(6)清洗：10 mL H2O清洗凈化柱。

(7)除水：抽真空除去殘余H2O。

(8)洗脫：用1 mL甲醇洗脫柱洗2次，第一次加入的甲醇需在柱子中保持5 min進(jìn)行活化柱子。

(9)將洗脫液濃縮。

(10)衍生：用移液管準(zhǔn)確吸取4.0 mL凈化液，置入離心管后在50℃下用氮?dú)獯蹈?，先后加?0 μL正己烷和10 μL三氟乙酸，渦旋30 s，在40℃的恒溫箱中放置15 min后，用50℃氮?dú)鈱⒀苌捍蹈?，用初始流動相定?.0 mL，渦旋30 s，過 0.2 μm濾膜后進(jìn)樣。

1.3.2 色譜條件

流動相分為A相（蒸餾水）、B相：乙腈-甲醇溶液（體積比50：50）；梯度洗脫：24%B（0～6 min），35%B（8.0～10.0 min），10%B（10.2～11.2 min），24%B（11.5～13.0 min）；色譜柱為C18柱，柱長250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5.0 μm；流速為1.0 mL / min；柱溫40℃；進(jìn)樣體積為50 μL；檢測激發(fā)波長為360 nm；發(fā)射波長為40 nm。

1.3.3 樣品測定

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度分別為0.01 μg/L、0.05 μg/L、0.10 μg/L、0.20 μg/L、0.40 μg/L、0.80 μg/L、1.50 μg/L依次進(jìn)樣檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)，AFT B1濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。將待測樣液進(jìn)樣分析，超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大濃度樣品進(jìn)行稀釋后再進(jìn)樣分析?？瞻自囼?yàn)則不稱取試樣，按照1.3.1步驟進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 結(jié)果分析

大米中AFT B1的含量按以下公式計算：

其中 X為大米中AFT B1的含量（μg/kg）；ρ：進(jìn)樣溶液中AFT B1按照外標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)的濃度（μg/L）；V1：試樣提取液體積（mL）；V3：凈化液的最終定容體積（mL）；V2：凈化柱凈化后的取樣液體積（mL）；m：試樣的稱樣量（g）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

用Statistics SPSS 22.0對檢驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分別對2018～2020年3年和四類抽樣場所采用單因素方差分析。

圖1 AFT B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC圖

圖2 大米樣品中AFT B1的HPLC圖

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及初篩結(jié)果

AFT B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC圖譜見圖1，其保留時間約為10.50 min，按照4.2中的方法將AFT B1標(biāo)準(zhǔn)溶液注入HPLC中，測定待測物質(zhì)AFT B1的信號響應(yīng)值，以AFT B1的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，AFT B1響應(yīng)信號值的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按其檢出限公式D.L.=3SD/k計算得出AFT B1的檢出限為0.03 μg/kg。對濃度為10 μg/L的AFT B1標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行11次平行測定，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值不大于0.9%。說明該試驗(yàn)滿足大米中AFT B1的分析要求。其線性方程為y=17256x-10325（R2= 0.9999）。

按照步驟將202批次大米處理后進(jìn)入HPLC—熒光檢測分析。本次202批次樣品大米中的AFT B1含量均未超標(biāo)，實(shí)際大米樣品譜圖見圖2。

2.2 2018～2020年度深圳特區(qū)大米樣品中AFT B1含量統(tǒng)計分析

表2中可見2018年深圳特區(qū)大米中AFT B1的含量為2.537 μg·kg-1、2019 年為 2.621 μg·kg-1、2020 年為 2.455 μg·kg-1，三組數(shù)據(jù)的相差絕對值分別為 0.084 μg·kg-1、0.166 μg·kg-1和0.082 μg·kg-1，差值并不明顯，經(jīng)方差分析得到其概率P值為0.451，明顯大于設(shè)置的顯著性水平0.05（表3）。該分析表明在2018年至2020年這三年間深圳特區(qū)大米中的AFT B1含量并無顯著性差異。

表2 2018～2020年深圳特區(qū)大米樣品AFT B1含量統(tǒng)計分析表

表3 2018～2020年深圳特區(qū)大米樣品AFT B1含量的方差分析表

2.3 深圳特區(qū)四類抽樣場所的大米中AFT B1含量統(tǒng)計分析

我們選擇四類抽樣地點(diǎn)分別是農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場、大超市、中小超市和大米企業(yè)。由表4可知農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場46批次的大米樣品平均AFT B1含量為4.441 μg·kg-1，中小超市為2.135 μg·kg-1、大超市為 2.049 μg·kg-1、大米企業(yè)為 1.527 μg·kg-1，其相差最大值為2.914 μg·kg-1。經(jīng)SPSS方差分析得到顯著性水平P＜0.05，說明四個采樣場所間存在著顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義（見表5）。

表4 四類抽樣地點(diǎn)大米樣品AFT B1含量統(tǒng)計分析表

表5 四類抽樣地點(diǎn)大米樣品AFT B1含量的方差分析表

3 結(jié)論

2018～2020 連續(xù)三年202批次大米樣品進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，AFT B1 含 量 均 值 分 別 為 2.537μg·kg-1、2.621μg·kg-1、2.455μg·kg-1，低于GB 2761-2017中規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)限量10 μg·kg-1，AFT B1含量均值在年份之間的差異并不顯著，且沒有發(fā)現(xiàn)超標(biāo)樣品。對四類不同場所抽樣檢測發(fā)現(xiàn)AFT B1含量均值由高到低分別為：農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場4.441μg·kg-1、中小超市2.135 μg·kg-1、大超市 2.049 μg·kg-1、企業(yè) 1.527 μg·kg-1。抽檢地點(diǎn)之間差異顯著，其中農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場AFT B1含量均值明顯高于其他三類抽樣地點(diǎn)，抽樣中發(fā)現(xiàn)，農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場店鋪空間有限，倉庫位置不佳，且倉庫簡陋，通風(fēng)設(shè)施和溫度控制設(shè)施不完善，加之深圳氣候濕潤，使大米處于陰濕環(huán)境易受黃曲霉污染。綜上所述，深圳特區(qū)大米中黃曲霉毒素B1污染程度相對較低，可放心食用。