李 勇，逄 濤，陳學(xué)軍，師君麗，隋學(xué)藝，顧華國

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南省玉溪市南祥路14 號(hào) 653100

煙堿是栽培煙草（Nicotiana tabacum）的主要生物堿，約占栽培煙草生物堿總量的95%［1］。降煙堿是煙堿的去甲基化產(chǎn)物，在栽培煙草中含量較少，但在其祖先種絨毛狀煙草（Nicotiana tomentosiformis）［2］和 林 煙 草（Nicotiana sylvestris）［3］中含量較高，是這些煙草的主要生物堿。Siminszky 等［4］證實(shí)了煙堿向降煙堿的轉(zhuǎn)化由名為CYP82E47 的細(xì)胞色素P450 單氧化酶調(diào)節(jié)，而CYP82E47 則受葉片老化相關(guān)信號(hào)通道調(diào)節(jié)［5］。在栽培煙草中，煙堿向降煙堿的轉(zhuǎn)化主要發(fā)生在煙葉衰老和調(diào)制過程中。栽培煙草中可將大部分煙堿轉(zhuǎn)化為降煙堿的突變植株被稱為“轉(zhuǎn)化株”［6］。白肋煙和烤煙中關(guān)于轉(zhuǎn)化株的報(bào)道很多［7-8］。轉(zhuǎn)化株中煙堿含量很低，而降煙堿、N-亞硝基降煙堿（N-nitrosonornicotine，NNN）［9］和麥斯明［10-11］等含量則成倍上升，該變化可導(dǎo)致轉(zhuǎn)化株煙葉的評(píng)吸質(zhì)量降低，致癌風(fēng)險(xiǎn)上升。在白肋煙群體中，最多可出現(xiàn)20%的轉(zhuǎn)化株［4］?？緹熮D(zhuǎn)化株被稱為“硃砂煙”或“櫻紅煙”［12］，烤煙群體中轉(zhuǎn)化株比例約為0.6%［13］。與白肋煙相比，正?？緹煹腘NN 含量較低（約為白肋煙的1%或更少），故烤煙轉(zhuǎn)化株中的NNN 濃度遠(yuǎn)低于白肋煙和白肋煙轉(zhuǎn)化株。

從栽培煙草群體中識(shí)別和去除轉(zhuǎn)化株有利于保障生產(chǎn)煙葉的品質(zhì)穩(wěn)定。轉(zhuǎn)化株鑒別一般采用乙烯、乙烯利、碳酸氫鈉等激化劑促進(jìn)轉(zhuǎn)化株的煙堿在較短時(shí)間內(nèi)大量向降煙堿轉(zhuǎn)化，再通過測定煙堿和降煙堿的含量對(duì)轉(zhuǎn)化株進(jìn)行判別［14-15］。然而這些方法多側(cè)重于檢測大田煙株，且鑒定通常需要幾天時(shí)間。從苗盤幼苗中快速篩除轉(zhuǎn)化株相比大田期篩除更為高效，但目前相關(guān)方法還未見報(bào)道。為此，本研究中擬通過對(duì)煙草幼苗期轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株生物堿含量特征的研究，旨在建立一種對(duì)苗盤幼苗煙草轉(zhuǎn)化株的快速鑒定方法。

1 材料和方法

1.1 育苗和采樣

將云煙85（烤煙）、云煙85 轉(zhuǎn)化株（烤煙）、TN90（白肋煙）和克撒錫巴斯瑪（香料煙）等煙草種子播種在溫室中各自的苗盤（9×18 孔，孔徑：3 cm×3 cm）內(nèi)。播種后第45～55 d 進(jìn)行取樣。對(duì)于每一株幼苗，取其最大葉片（長寬乘積大于40 cm2）。將采集的葉片沿主脈對(duì)折，然后再對(duì)折。采用直徑為6 mm 的打孔器在折后煙葉上進(jìn)行3 次打孔（打孔時(shí)盡量使3 個(gè)孔在折后煙葉上分布均勻），收集12 個(gè)直徑為6 mm 的圓形葉塊，放入1.5 mL塑料離心管中。采集的樣品可直接進(jìn)行溶劑提取或在37 ℃下孵化12 h 后進(jìn)行溶劑提取。為防止種子自然突變現(xiàn)象對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，所有實(shí)驗(yàn)煙苗均采用基于Shi 方法［14］的程序進(jìn)行孵化，即樣品在37 ℃和80%相對(duì)濕度下孵育7 d，然后取出進(jìn)行分析，確定其是否為轉(zhuǎn)化株。

1.2 生物堿提取

采用甲基叔丁基醚（Methyl tert-butyl ether，MTBE）作提取劑，喹啉作內(nèi)標(biāo)。每個(gè)幼苗樣品中同時(shí)加入0.3 mL 喹啉溶液（溶劑為MTBE）和0.5 mL 2.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的氫氧化鈉溶液，渦旋1 min，萃取液靜置分層，取150 μL 上清液轉(zhuǎn)移至氣相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣小瓶進(jìn)行儀器分析。

1.3 儀器分析

采用Agilent 7890A 氣相色譜儀（美國Agilent公司）與5977B 質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。色譜柱為DB-5 MS 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。分流比為20∶1，進(jìn)樣量為2 μL。分離溫度為270 ℃恒溫，分離時(shí)間為1.8 min，每個(gè)樣品儀器總運(yùn)行時(shí)間約3.5 min。載氣（氦氣）流量為1.0 mL/min。采用選擇離子模式（SIM）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。煙堿、降煙堿和喹啉的分析離子分別設(shè)為84、70 和129。采用電子轟擊（EI）模式電離，電離電壓為70 eV，檢測器電壓為1.0 kV。離子源和傳輸線溫度分別保持在200 ℃和300 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Agilent MSD ChemStation F.01.03.2357 化學(xué)工作站對(duì)所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行自動(dòng)峰識(shí)別和積分。手動(dòng)檢查積分錯(cuò)誤并在必要時(shí)重新積分。用于校正曲線的煙堿和降煙堿的濃度范圍分別為0.78～50.00 μg/mL 和0.15～10.00 μg/mL。內(nèi)標(biāo)（喹啉）濃度為1.0 μg/mL。使用MSD 化學(xué)工作站完成定量校準(zhǔn)，并將所得數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移到Excel 軟件中進(jìn)行進(jìn)一步分析。用煙堿轉(zhuǎn)化百分比（Percent nicotine conversion，PNC）區(qū)分轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株。PNC 定義為降煙堿濃度（mol/L）除以煙堿和降煙堿總濃度（mol/L）的商。為簡化篩選轉(zhuǎn)化株的流程，本實(shí)驗(yàn)中還定義了擬PNC（Pseudo percent nicotine conversion，PPNC）。PPNC 定義為降煙堿峰面積除以煙堿和降煙堿總峰面積的商。使用PPNC 時(shí)無需使用煙堿和降煙堿的標(biāo)準(zhǔn)品，也無需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)中涉及的煙葉質(zhì)量均為鮮煙葉的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 采樣穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化株的快速篩選，本實(shí)驗(yàn)中在采樣時(shí)省略了稱樣步驟。評(píng)價(jià)了所采樣品質(zhì)量的穩(wěn)定性（表1），發(fā)現(xiàn)不同煙葉10 個(gè)樣品之間的質(zhì)量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.1%～4.8%之間，表明所使用的采樣方法可以采集質(zhì)量較為穩(wěn)定的樣品。其原因可能為苗盤煙苗所處的生長環(huán)境幾乎完全相同，所采葉片具有相似的厚度和密度。樣品質(zhì)量的穩(wěn)定性確保了所計(jì)算的PNC 或PPNC 的可比性。由于大田煙葉所處生長環(huán)境差異較大，如采用本實(shí)驗(yàn)使用的方法采樣可能導(dǎo)致不同樣本間的質(zhì)量差異較大。但由于PNC 或PPNC 的計(jì)算與采樣質(zhì)量無關(guān)，只要煙堿和降煙堿的濃度處于儀器的線性響應(yīng)范圍，采樣質(zhì)量的差異不會(huì)對(duì)PNC 和PPNC 的計(jì)算值產(chǎn)生影響。

表1 打孔器取樣獲得樣品的質(zhì)量分布Tab.1 Weight distribution of samples obtained by using hole punchers

2.2 葉片上采樣位置對(duì)分析結(jié)果的影響

為實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化株的快速篩選，本實(shí)驗(yàn)中從幼苗葉片中收集12 個(gè)葉塊作為一個(gè)樣品，而不是把整片葉子或整個(gè)植物作為樣本采集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，煙堿和降煙堿在幼苗葉邊緣的含量高于中間。而PNC 和PPNC 值在邊緣和中間采樣間無顯著差異。這表明葉片上的采樣位置對(duì)PNC 和PPNC 值影響不大。但仍建議對(duì)每片葉子進(jìn)行固定位置采樣，在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)對(duì)折后煙葉進(jìn)行打孔時(shí)，盡量使3 次打孔均勻分布于煙葉表面。

表2 葉面采樣位置對(duì)PNC 和PPNC 的影響①Tab.2 Influences of leaf sampling position on PNC and PPNC

2.3 葉片大小對(duì)分析結(jié)果的影響

對(duì)比分析了大葉采樣和小葉采樣對(duì)PNC 和PPNC 的影響（表3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙堿和降煙堿的含量在大葉和小葉之間沒有顯著差異，PNC 和PPNC 的差異也不明顯?？紤]到對(duì)太小的煙葉采樣時(shí)操作較困難，建議選擇長寬積超過40 cm2的葉片進(jìn)行采樣。

表3 葉面尺寸對(duì)PNC 和PPNC 的影響Tab.3 Influences of leaf size on PNC and PPNC

2.4 PNC 在未孵化幼苗中的分布

在不進(jìn)行孵化培養(yǎng)的情況下直接測定轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株中煙堿和降煙堿的含量并計(jì)算PNC。結(jié)果顯示，烤煙轉(zhuǎn)化株的煙堿含量低于非轉(zhuǎn)化株，而降煙堿的含量則高于非轉(zhuǎn)化株（表4）。這意味著在幼苗期，轉(zhuǎn)化株中的煙堿就已經(jīng)開始向降煙堿轉(zhuǎn)化。對(duì)221 株烤煙轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株群體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化株的PNC 均值為其非轉(zhuǎn)化株的4倍。這種差異表明可通過PNC 對(duì)幼苗轉(zhuǎn)化株進(jìn)行區(qū)分。通過對(duì)轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株中PNC 的分布（圖1b）進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，以PNC 值5%作篩選和去除轉(zhuǎn)化株的判斷點(diǎn)時(shí)，可以在損失7%的非轉(zhuǎn)化株的情況下去除99%的轉(zhuǎn)化株；以PNC 值4%作判斷點(diǎn)時(shí)，可以在損失21%的非轉(zhuǎn)化株的前提下完全去除轉(zhuǎn)化株。該方法雖有部分非轉(zhuǎn)化株損失，但可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化株的快速篩除。

根據(jù)文獻(xiàn)［4，15］，白肋煙和香料煙群體中轉(zhuǎn)化株的最高比例分別可達(dá)20%和10%。由于未獲得白肋煙和香料煙的轉(zhuǎn)化株種子，本研究中嘗試使用Shi 等的方法［14］從這兩個(gè)品種的幼苗中篩選出轉(zhuǎn)化株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，但未成功。將白肋煙和香料煙的非轉(zhuǎn)化株與烤煙非轉(zhuǎn)化株進(jìn)行比較（表4），發(fā)現(xiàn)白肋煙非轉(zhuǎn)化株與烤煙非轉(zhuǎn)化株具有相似的煙堿和降煙堿含量，因而其PNC 值也很接近。香料煙非轉(zhuǎn)化株的煙堿含量比烤煙非轉(zhuǎn)化株低，但降煙堿含量相當(dāng)，因此導(dǎo)致香料煙非轉(zhuǎn)化株的PNC 值整體大于白肋煙和烤煙。預(yù)計(jì)白肋煙轉(zhuǎn)化株的PNC 值分布與烤煙轉(zhuǎn)化株相似，但這種推測需通過較大樣本量的白肋煙轉(zhuǎn)化株進(jìn)行驗(yàn)證。

2.5 PPNC 的使用

由于PNC 是根據(jù)煙堿和降煙堿的絕對(duì)定量計(jì)算得出的，PNC 的值受標(biāo)準(zhǔn)品純度和校準(zhǔn)曲線質(zhì)量的影響。為簡化判別并消除潛在誤差，本實(shí)驗(yàn)中定義了PPNC。對(duì)PNC 和PPNC 進(jìn)行線性擬合，發(fā)現(xiàn)兩者存在顯著的線性相關(guān)（R2=0.996 8，圖1a）。比較PNC 和PPNC 對(duì)烤煙轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株群體（轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株分別為106 株和154株）的區(qū)分，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化株的PNC 和PPNC 分別為非轉(zhuǎn)化株的3.8 倍和4.5 倍（表4）。進(jìn)一步考察兩者對(duì)轉(zhuǎn)化株的區(qū)分效果（圖1b、圖1c），發(fā)現(xiàn)根據(jù)PPNC 值0.9%對(duì)轉(zhuǎn)化株進(jìn)行篩選，可在損失8%非轉(zhuǎn)化株的情況下實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化株的完全剔除。而采用PNC 值進(jìn)行判別時(shí)，要達(dá)到轉(zhuǎn)化株的完全剔除，需損失21%的非轉(zhuǎn)化株。因此，本研究中PPNC 的計(jì)算比PNC 更簡單，且用于轉(zhuǎn)化株篩除時(shí)效果更佳。

圖1 PNC 和PPNC 之間的相關(guān)關(guān)系以及兩者在轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株中的數(shù)值分布Fig.1 Distribution and correlation of PNC and PPNC in converters and non-converters

表4 轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株的PNC 和PPNC 值分布Tab.4 Distribution of PNC and PPNC in converters and non-converters

2.6 孵化煙葉以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株的完全分離

從烤煙群體中轉(zhuǎn)化株（106 株）和非轉(zhuǎn)化株（154 株）的PNC 分布可知，即使兩者的PNC 均值差異很大，轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株群體之間仍存在PNC 或PPNC 重疊的現(xiàn)象（圖1b、圖1c）。采用未孵化煙葉的PNC 或PPNC 進(jìn)行轉(zhuǎn)化株的篩選時(shí)，要么需損失篩選的準(zhǔn)確性，要么需損失部分非轉(zhuǎn)化株煙苗。而文獻(xiàn)報(bào)道的轉(zhuǎn)化株篩選方法，均采用激化劑（乙烯、乙烯利或碳酸氫鈉）對(duì)煙苗進(jìn)行孵化培養(yǎng)，以擴(kuò)大轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株之間的PNC 差異［14-15］。這些方法均需在合適激化劑存在并控制溫度和濕度培養(yǎng)幾天方可實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在37 ℃下孵化所采集的煙葉樣品（密封于1.5 mL離心管中）12 h 后，轉(zhuǎn)化株的PNC 和PPNC 分別增加了3.1 倍和3.7 倍，而非轉(zhuǎn)化株的PNC 和PPNC 均沒有顯著變化（圖2a、圖2b）。孵化實(shí)驗(yàn)促進(jìn)了轉(zhuǎn)化株中煙堿向降煙堿的轉(zhuǎn)化，使得轉(zhuǎn)化株群體和非轉(zhuǎn)化株群體的PNC 或PPNC 不再有重疊（圖2c、圖2d）。因此，如果不要求對(duì)轉(zhuǎn)化株進(jìn)行現(xiàn)場即時(shí)篩選，可將所采集的樣品在37 ℃下培育12 h 后再進(jìn)行溶劑提取和儀器分析。

圖2 孵化對(duì)區(qū)分轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株的影響Fig.2 Influences of incubation on discrimination of converters and non-converters

3 討論

Shi 等［14］優(yōu)化了轉(zhuǎn)化株的孵化條件（包括溫度、相對(duì)濕度和激化劑），以實(shí)現(xiàn)煙堿的最大轉(zhuǎn)化，然后根據(jù)最大轉(zhuǎn)化率篩選轉(zhuǎn)化株。該方法中孵化反應(yīng)耗時(shí)4～6 d，測定煙堿和降煙堿的含量再需幾個(gè)小時(shí)，雖然有效但較為費(fèi)時(shí)，故不太適合大規(guī)模煙株樣本的篩查。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)孵化培養(yǎng)的幼苗轉(zhuǎn)化株的平均PNC 和PPNC 分別為非轉(zhuǎn)化株的3.8 和4.5 倍。采用PPNC 進(jìn)行篩查時(shí)可在只損失8%非轉(zhuǎn)化株的前提下實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化株的完全剔除。因此，如需快速篩查，可采用不孵化培養(yǎng)的方式進(jìn)行篩選。

本實(shí)驗(yàn)中簡化了煙堿和降煙堿的測定方法，取消樣品研磨和稱樣步驟，縮短了樣品提取時(shí)間，優(yōu)化了氣質(zhì)聯(lián)用分析方法（采用270 ℃恒溫模式而不是程序升溫），最終使得整個(gè)鑒定過程只需5～6 min（圖3，方法A）。若需完全分離轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株，只需要在樣品提取之前將采集的樣品在37 ℃下孵育12 h 即可（圖3，方法B）。此外，本實(shí)驗(yàn)中引入了PPNC 作為PNC 的簡化方案。PPNC 比PNC 更容易獲得，且不受標(biāo)準(zhǔn)品純度、標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量等因素影響，一定程度上比PNC 具有更好的篩選效果。

圖3 直接鑒定煙堿轉(zhuǎn)化株（方法A）和孵育后鑒定轉(zhuǎn)化株（方法B）的流程圖Fig.3 Flow charts of direct identification of nicotine converters（A）and identification after incubation（B）

文獻(xiàn)［14］中使用了包括乙烯，乙烯利和碳酸氫鈉等刺激劑促進(jìn)煙堿轉(zhuǎn)化，而碳酸鈉被認(rèn)為與乙烯和乙烯利具有相同的刺激效果。本實(shí)驗(yàn)中比較了使用和不使用0.8%碳酸氫鈉處理的轉(zhuǎn)化株幼苗，發(fā)現(xiàn)2 種處理的PNC 無明顯差異，這可能與本實(shí)驗(yàn)在封閉系統(tǒng)里進(jìn)行孵化處理有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)中在進(jìn)行孵化培養(yǎng)時(shí)無需外加激化劑。

根據(jù)Shi 等［14］的方法，為實(shí)現(xiàn)煙堿的最大轉(zhuǎn)化需控制相對(duì)濕度，適當(dāng)?shù)臐穸瓤纱_保轉(zhuǎn)化相關(guān)酶的活性。本實(shí)驗(yàn)中將葉片樣品密封在1.5 mL 離心管中進(jìn)行孵育，葉片的水分被封鎖在離心管中，因此無需提供額外的環(huán)境濕度。采用這種方法，轉(zhuǎn)化株的PNC 和PPNC 分別增加了3.1 倍和3.7 倍（圖2a、圖2b），而非轉(zhuǎn)化株則沒有變化。由于本實(shí)驗(yàn)中無需額外控制孵化反應(yīng)的濕度，簡化了反應(yīng)條件，使得孵化反應(yīng)可在任何溫度可控的環(huán)境下進(jìn)行。

4 結(jié)論

本研究中建立了一種快速鑒定煙草幼苗群體中煙堿轉(zhuǎn)化株的方法，該方法采用打孔器取樣，樣品無需研磨，直接提取（或密封培養(yǎng)后提?。┖筮M(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜快速分析，可在幾分鐘或十幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成轉(zhuǎn)化株的篩除，為大批量快速篩查煙草幼苗中的煙堿轉(zhuǎn)化株提供了技術(shù)方案。