趙偉杰，劉 婧，李 芃，郭振勇#

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院藥物臨床試驗機構辦公室，北京101149；2.首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院藥學部，北京 101149)

β-內酰胺類抗菌藥物是臨床常用的抗菌藥物，但幾乎沒有用于抗結核治療的品種，究其原因是結核桿菌中天然存在β-內酰胺酶，從而導致β-內酰胺類抗菌藥物失去抗菌效果[1]。上述情況直至碳青霉烯類抗菌藥物的出現(xiàn)才有所改變[2]。因為碳青霉烯類抗菌藥物是β-內酰胺酶的不良底物，這個特性使得碳青霉烯類抗菌藥物的水解速度降低[3]。有文獻報道，碳青霉烯類抗菌藥物與β-內酰胺酶抑制劑聯(lián)合應用時，體內外均對結核桿菌有較好的抗菌活性[4-7]。本研究試圖優(yōu)化碳青霉烯類抗菌藥物與β-內酰胺酶抑制劑的組合，以篩選出具有最高抗菌活性的組方，同時考察該組方與二線抗結核藥之間的相互作用。

1 材料

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司，型號為HERAcell 150i)；生物安全柜(美國Nuaire公司，型號為CLASS Ⅱ)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司，型號為YXQ-LS-50)；-80 ℃低溫冰柜(日本三洋電機株式會社，型號為MDF-192)；電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司，型號為XS105)；超聲波清洗機(上海予皓科學儀器有限公司，型號為YH-200DH)；96孔無菌微孔板(美國Corning公司，型號為Coster 3596)。

1.2 菌株

結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)標準株H37Rv(ATCC 27294)由國家結核病臨床實驗室提供，27株臨床分離株均由國家結核病臨床實驗室提供。

1.3 藥品與試劑

異煙肼(INH，Sigma公司，批號：080M0254V)；左氧氟沙星(LFX，Sigma公司，批號：0001425507)；法羅培南(FP，正大天晴制藥有限公司，批號：01015003)；比阿培南(BP，正大天晴制藥有限公司，批號：151216125)；克拉維酸鉀(CLV，Aladdin Industrial Corporation公司，批號：D1529045)；舒巴坦(SBT，中國藥品生物制品檢定所，批號：130430-201007)；他唑巴坦(TBT，陜西北元化工集團有限公司，批號：30192312080043)；利福平(RIF，Sigma，批號：78H0773)；利奈唑胺(LZD，輝瑞制藥有限公司，批號：11C15Z10)；鏈霉素(SM，Sigma公司，批號：117K0719)；莫西沙星(MFX，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：BXFZG31)；乙胺丁醇(EMB，Sigma公司，批號：050M0034)；對氨基水楊酸鈉(PAS，遼寧倍奇藥業(yè)有限公司，批號：1107191)；卡那霉素(KM，Sigma公司，批號：25389-94-0)；丙硫異煙胺(PTO，遼寧康博士藥業(yè)有限公司，批號：M-120201)；卷曲霉素(CPM，Sigma公司，批號：018K1068)；阿米卡星(Am，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號：120606)；氯苯酚嗪(CLF，南京立業(yè)制藥有限公司，批號：1003081)。7H9培養(yǎng)基(美國BD公司，批號：6075662)；ADC營養(yǎng)增殖液(白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶，美國BD公司，批號：2349131)；Alamar Blue(美國Bio-Rad公司，批號：170330)；吐溫-80(Tween-80，北京索萊寶科技有限公司，批號：301C052)；二甲基亞砜(DMSO，MP生物醫(yī)療公司，批號：Y190601)。RIF、LFX、PTO及CLF以DMSO溶解制成儲存液；INH、SM、EMB、PAS、KM、CPM、FP、BP、CLV、SBT及TBT以滅菌蒸餾水分別溶解制成儲存液，用0.22 μm濾頭過濾；LZD、MFX及Am以注射劑作為儲存液，均置-80 ℃冰箱保存。

2 方法

2.1 菌株的培養(yǎng)

2.1.1 MTB標準株H37Rv的培養(yǎng)：保存在-80 ℃的菌種接種于含10% ADC的7H9培養(yǎng)基(含0.05%吐溫-80)中，使菌液終濃度為104CFU/ml，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d至濁度為麥氏比濁管1(菌濃度為107CFU/ml)時，以含10% ADC的7H9培養(yǎng)基稀釋為106CFU/ml的菌懸液后使用。

2.1.2 臨床分離株的培養(yǎng)：取生長在羅氏培養(yǎng)基上3～4周的患者痰中培養(yǎng)的菌落，研磨，加0.9%氯化鈉溶液至濁度為麥氏比濁管1(菌濃度為107CFU/ml)，用含10% ADC的7H9培養(yǎng)基稀釋為106CFU/ml的菌懸液后使用。

2.2 96孔微孔板阿爾瑪藍染色法(microplate alamar blue assay，MABA)測定最低抑菌濃度(MIC)

2.2.1 對MTB標準株H37Rv的MIC：在96孔微孔板中以7H9培養(yǎng)基為溶劑，二倍稀釋法稀釋各藥物。藥物在96孔板中的濃度(H37Rv)見表1。每孔體積為100 μl，各孔加入“2.1.1”項下的菌液100 μl，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，第7日加入Alamar Blue 20 μl和20%吐溫-80 12.5 μl，37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將阻止顏色變化(從藍色變?yōu)榉凵?的最低藥物濃度定義為藥物最低抑菌濃度(MIC)[8]。

表1 藥物在96孔板中的濃度(H37Rv)(μg/ml)Tab 1 Concentration of drugs in 96 microplate (H37Rv)(μg/ml)

2.2.2 對25株臨床分離株的MIC：方法同“2.2.1”項，RIF、INH以80 μg/ml的最高質量濃度進行二倍稀釋，其他藥物質量濃度同表1。

2.2.3 FP、BP與CLV、SBT、TBT配比：將FP、BP分別與CLV、SBT、TBT混合比值第一步設為1∶1，待確定選擇哪個β-內酰胺酶抑制劑最有效后，進一步設定FP、BP與β-內酰胺酶抑制劑的比例為1∶1、2∶1、4∶1和β-內酰胺酶抑制劑為固定濃度2.5 μg/ml等4種比例配方。以上實驗均按“2.2.1”項操作配置藥物，96孔板中碳青霉烯類抗菌藥物終濃度分別為16～0.25 μg/ml，采用MABA法測定對H37Rv的MIC，確定最優(yōu)配方；固定配方后測定此配方對27株臨床分離株的MIC，以驗證配方。

2.2.4 碳青霉烯類抗菌藥物/β-內酰胺酶抑制劑與其他抗結核藥的體外相互作用：以棋盤法完成，選取6種常用二線抗結核藥LZD、LFX、CPM、CLF、PAS及PTO，測定這6種藥物與“2.2.3”項獲得的FP、BP與β-內酰胺酶抑制劑的最優(yōu)配方之間的體外相互作用。分別配置BP/FP+CLV與LZD、LFX、CPM、CLF、PAS、PTO兩兩藥物組合溶液(藥物濃度見表2)[9]；按“2.2.1”項下操作測定對H37Rv的MIC，以分級抑菌濃度(FIC)評價藥物體外相互作用[9](FIC見表3—4)，F(xiàn)IC=(MICA聯(lián)合/MICA單獨)+(MICB聯(lián)合/MICB單獨)。

表2 藥物加入96孔板時的濃度(μg/ml)Tab 2 Concentration of drugs when added into 96 microplat (μg/ml)

表3 FP/CLV與抗結核藥兩兩聯(lián)合應用的抑菌作用Tab 3 Inhibitory effects of FP/CLV combined with anti-tuberculous drug

3 結果

3.1 藥物對H37Rv的MIC

藥物對H37Rv的MIC：INH為0.05 μg/ml；RIF為0.05 μg/ml；LZD、SM、LFX為0.5 μg/ml；MFX為0.125 μg/ml；PAS為0.25 μg/ml；EMB、PTO、KM、CPM為2 μg/ml；AM為1 μg/ml；CLF為0.24 μg/ml。

表4 BP/CLV與抗結核藥兩兩聯(lián)合應用的抑菌作用Tab 4 Inhibitory effects of BP/CLV combined with anti-tuberculous drug

3.2 藥物對臨床分離株的MIC

25株臨床分離株中，21株為耐多藥結核菌株(MDR-TB菌株，即耐RIF和INH的結核菌株)，4株為廣泛耐藥結核菌株(XDR-TB菌株，即耐RIF、INH、任何氟喹諾酮類以及3種二線注射劑中一種的結核菌株)(具體數(shù)值未列出)。

3.3 FP/BP與β-內酰胺酶抑制劑的配比

對H37Rv的MIC分別為：FP、BP均為8 μg/ml，3種β-內酰胺酶抑制劑均>64 μg/ml，F(xiàn)P/CLV為2/2 μg/ml，F(xiàn)P/SBT、FP/TBT均為4/4 μg/ml；BP/CLV為1/1 μg/ml，BP/SBT、BP/TBT均為2/2 μg/ml，以此確定FP、BP與CLV組合。進一步測定FP、BP與β-內酰胺酶抑制劑分別以1∶1、2∶1、4∶1比例組合及β-內酰胺酶抑制劑為固定濃度(2.5 μg/ml)的藥物組合對H37Rv的MIC，結果表明，比例為1∶1及β-內酰胺酶抑制劑在組合中為2.5 μg/ml固定濃度時MIC最低，F(xiàn)P在組合中為2 μg/ml，BP在組合中為1 μg/ml，參考國內外眾多研究碳青霉烯類抗菌藥物的抗結核活性實驗中CLV的濃度均固定于2.5 μg/ml，最終選擇了β-內酰胺酶抑制劑為固定濃度2.5 μg/ml的藥物組合。

3.4 對25株臨床分離株的MIC

FP/CLV(以FP質量濃度表示)對4株臨床分離株的MIC為8 μg/ml，對13株臨床分離株的MIC為4 μg/ml，對7株臨床分離株的MIC為2 μg/ml，對1株臨床分離株的MIC為1 μg/ml，F(xiàn)P/CLV對22株臨床分離株(占88%，22/25)的MIC比FP的MIC低2～4倍；BP/CLV(以BP質量濃度表示)對4株臨床分離株的MIC為8 μg/ml，對4株臨床分離株的MIC為4 μg/ml，對11株臨床分離株的MIC為2 μg/ml，對5株臨床分離株的MIC為1 μg/ml，對1株臨床分離株的MIC為0.5 μg/ml，BP/CLV對23株臨床分離株(占92%，23/25)的MIC比BP的MIC低4～8倍(具體數(shù)值未列出)。

3.5 體外相互作用

FP/CLV與PAS、PTO之間的FIC為0.375，顯示FP/CLV與上述2藥之間存在協(xié)同作用，F(xiàn)P/CLV與LZD、LFX、CPM、CLF為無關作用；BP/CLV與CPM、PAS、PTO之間的FIC為0.375，顯示BP/CLV與CPM、PAS、PTO之間存在良好的協(xié)同作用；BP/CLV與CLF的FIC為0.75，意味著兩者存在相加作用；BP/CLV與LZD、LFX的FIC為0.625，為部分協(xié)同作用。

4 討論

肽聚糖是細菌細胞壁的主要成分，通常情況下一般是由乙酰氨基葡萄糖、乙酰胞壁酸等經D,D-羧肽酶催化形成的4-3鏈接相互鉸鏈而成，可以被β-內酰胺酶類抗菌藥物抑制。但是在MTB中，4-3鏈接和3-3鏈接均存在。當結核菌處于繁殖期時，兩種鏈接的比例相當；當結核菌處于靜止期時，3-3鏈接占的比重較大，可達80%。上述鏈接是由L,D-轉肽酶催化形成的。因此，只有當藥物可同時抑制D,D-羧肽酶、L,D-轉肽酶時，MTB才能被殺滅。體外研究結果表明，亞胺培南、FP均可抑制D,D-羧肽酶和L,D-轉肽酶[10-12]。

對于不同的細菌，不同的β-內酰胺酶抑制劑以及抗菌藥物與β-內酰胺酶抑制劑不同的配比，其抗菌活性是不同的。這可能與細菌的耐藥機制有關。對于MTB標準株H37Rv，F(xiàn)P/CLV的濃度比為1∶1時，其MIC為2 μg/ml；當BP與CLV的濃度比1∶1時，其MIC為1 μg/ml。鑒于目前市場上沒有CLV制劑，所以臨床上常用阿莫西林克拉維酸鉀代替(含CLV125 mg)，CLV的峰濃度為3～4 μg/ml；同時為了與國外的研究具有類比性，本研究測定了不同情況下FP、BP的MIC，CLV濃度為固定濃度(2.5 μg/ml)時FP、BP的MIC和FP、BP與CLV濃度比為1∶1時FP、BP的MIC相同。為了以后便于開展動物實驗和臨床推廣，在后續(xù)實驗中CLV的濃度均采用固定濃度2.5 μg/ml。雖然多數(shù)研究在治療方案中均采用聯(lián)合碳青霉烯類抗菌藥物與β-內酰胺酶抑制劑的方法，也有研究對于單獨使用FP聯(lián)合LZD、吡嗪酰胺的方案進行了嘗試，結果顯示，加入FP后的方案不能提高原方案(LZD+吡嗪酰胺)的抗菌活性，但未提及造成上述結果的原因是β-內酰胺酶抑制劑的缺失，還是FP自身的活性低[13]。另一項研究結果則認為，F(xiàn)P單獨使用，其體外誘導MTB快速溶解的能力甚至強于INH[14]。

耐藥結核病的出現(xiàn)是消滅結核病的嚴重阻礙之一[15]。為了提高療效和(或)克服耐藥，臨床上常會采取聯(lián)合用藥的方式[16-18]。結核病的治療，尤其是耐藥結核病的治療，均要求采用聯(lián)合用藥的方式[19]。因此，在制定治療方案時，考察藥物之間的相互作用尤為重要。具有良好協(xié)同作用的藥物聯(lián)合應用方案可以提高療效或者可以在療效相同的情況下減少藥物的用量，進而可能減少藥物的不良反應。本研究中，F(xiàn)P/CLV與PAS、PTO之間，BP/CLV與CPM、PAS、PTO之間存在良好的協(xié)同作用，因此，在制定治療方案時，上述研究結果可以為醫(yī)師提供參考。

從藥動學考慮，在臨床常用劑量下，BP的谷濃度是>1 μg/ml的[20]，此濃度相當于單獨使用時對敏感MTB的MIC；當BP/CLV與PAS、PTO分別聯(lián)合使用時，其MIC進一步降至0.125 μg/ml，因此，從理論上講，這些藥物組合可以產生良好的協(xié)同作用。由于治療耐藥結核病的療程遠遠長于一般感染性疾病，因此，方案的安全性也是必須考慮的內容[21-22]。BP的安全性研究結果表明，1 000 mg、每8 h給藥1次的用藥方法，患者能夠很好地耐受，且未發(fā)現(xiàn)中樞神經系統(tǒng)癥狀，所以其安全性遠高于亞胺培南[23]。另外，對于非MTB，如膿腫分枝桿菌，F(xiàn)P也表現(xiàn)出較高的抗菌活性，因此，本研究結果也可為該類疾病的治療提供思路[24]。

在碳青霉烯類抗菌藥物中，亞胺培南、美羅培南、BP及厄他培南均有報道可以用來治療耐藥結核病或者廣泛耐藥結核病，且上述藥物對MTB的MIC均低于FP，本研究中FP/CLV的MIC也高于BP，但由于耐藥結核病的療程至少需要18個月，且多數(shù)是門診治療，所以使用口服藥就更為方便，這也是耐藥結核病治療的一個方向[25-26]。因此，作為碳青霉烯類抗菌藥物中唯一可以口服的藥品，F(xiàn)P在這一方面具有獨特的優(yōu)勢[27]。滯留菌或者非復制MTB的存在是結核病復發(fā)的一個重要原因，已經有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)P聯(lián)合MFX、特地唑胺對該類細菌是有效的[28]。因此，有必要對FP進一步研究。

本研究的結果也存在著局限性：(1)上述結果僅為體外實驗的結果，藥物的療效歸根到底是由藥物的體內抗菌活性來決定的，所以體外實驗的結果還需要體內研究進行驗證[29]。(2)由于結核菌是一種典型的胞內寄生菌，而胞內寄生菌往往是結核病復發(fā)的關鍵因素，所以考察藥物的細胞內抗菌活性也關系到方案在臨床使用過程中的有效性。(3)由于碳青霉烯類抗菌藥物在水溶液中是不穩(wěn)定的，因此在研究過程中，可能會因為藥物在培養(yǎng)基中的水解造成對藥物活性的評價偏低。這些也將是下一步的研究目標。