陳繼美,陳 奮
(1.廣西貴港市桂平市石龍鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站,廣西 桂平 537200;2.桂平市金田鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站,廣西 桂平 537200)
玉米赤霉烯酮(ZEN)是一種真菌毒素,會(huì)在適應(yīng)的環(huán)境條件下產(chǎn)生,它又被稱為F-2毒素,可以由多種菌種轉(zhuǎn)變而成,常見的菌種有尖孢鐮刀菌、三線鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、禾谷鐮刀菌等,具有與雌激素相似的作用,可以造成生殖毒性和致畸。通過檢測(cè)雞飼料及原料是否含有玉米赤霉烯酮的方式來監(jiān)控飼料的污染情況。
本次研究使用免疫親和柱、色譜純、甲醇、乙腈等材料,親和柱選用的是helix玉米赤霉烯酮免疫親和柱,并選用10 mg的玉米赤霉烯酮進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在分析提出方面采用廣州市廣聯(lián)津化工有限公司的去離子水、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等物品。
試劑制作的步驟:明確試劑提取標(biāo)準(zhǔn),試劑提取標(biāo)準(zhǔn)為乙腈與水的比例為9:1。制作磷酸鹽緩沖液,制作標(biāo)準(zhǔn)為pH 7.4(50 mm PBS),需要使用磷酸氫二鉀7.27 g、磷酸二氫鉀1.24 g、氯化鈉8.76 g進(jìn)行溶解,離子水的含量為1L。
設(shè)備儀器采用的是美國Agilent公司出品的熒光檢測(cè)器和Agilent1260高效液相色譜儀。同時(shí)使用空氣壓力泵、超聲振蕩儀、SPE固相萃取裝置、渦旋混合器、離心機(jī)等設(shè)備儀器[3]。
1.3.1 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液
標(biāo)準(zhǔn)溶液配制需要采用玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)物和甲醇2種材料,然后準(zhǔn)確稱取適量的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)物并與甲醇進(jìn)行溶解,配制的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液濃度保持在100.0 μg/mL(參考資料數(shù)據(jù)),再用超純水分別配成5份濃度不同的工作溶液,濃度分別是10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、200 μg/L、500 μg/L,等待測(cè)量。
1.3.2 制備與提取試樣
精準(zhǔn)稱取20 g樣品,將其進(jìn)行粉碎,放入100 mL的離心管中,在離心管中加入50 mL提取液,通過渦旋混合器攪拌均勻,攪拌時(shí)間為1 min,將攪拌好的試劑放入超聲波清洗器內(nèi)30 min,在過程中對(duì)試劑震蕩2~3次,每次速度為10 000 r/min離心,持續(xù)時(shí)間5 min,然后倒入試管進(jìn)行備用。接著取出其1 mL,在清液中加入9 mL磷酸鹽緩沖液,攪拌均勻。
1.3.3 樣品凈化
將免疫親和柱放置在玻璃注射器下,然后取出10 mL的試樣放入玻璃注射器中。通過調(diào)節(jié)壓力方式讓試樣慢慢經(jīng)過玻璃注射器,使清液流入免疫親和柱中,注意控制清液流速在1滴/s。待清液完全進(jìn)入親和柱后,再用20 mL去離子水淋洗免疫親和柱,速度為1~2滴/s,當(dāng)液體全部進(jìn)入親和柱后抽干玻璃注射器的液體和空氣。
1.3.4 洗脫
洗脫需要在免疫親和柱中進(jìn)行。具體方式:先加入0.5 mL甲醇,待30 s后,再加入0.5 mL,然后收集洗脫液,并使用0.22~0.45μm有機(jī)濾膜進(jìn)行過濾,并將過濾得出的液體放入機(jī)器。
1.3.5 高效液相色譜條件
色譜柱需要保持柱溫為30℃,采用的是C18柱色譜柱。流動(dòng)相采用比例為75:25的甲醇水,保持流速為1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)的條件是發(fā)射波長(zhǎng)440 nm,激發(fā)波長(zhǎng)274 nm。
1.3.6 測(cè)定樣品
在提取出雞飼料與原料中的樣品后,使用液相色譜分析法分析樣品的具體成分,將樣品放入提取液中進(jìn)行測(cè)量,進(jìn)樣量為100.0 μL。
玉米赤霉烯酮可以發(fā)出熒光,且顏色為藍(lán)綠色,可以通過熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。而且,根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為274 nm、射波長(zhǎng)為440 nm時(shí),最容易將米赤霉烯酮檢測(cè)出來。本次實(shí)驗(yàn)采用的是C18柱反相色譜柱,使用甲醇‐水作為流動(dòng)相,并且保持流速為1.0 mL/min。因此,根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件可以得出玉米赤霉烯酮的色譜峰,保留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)7.5 min,實(shí)驗(yàn)條件能夠滿足檢測(cè)需求。
在5種118批雞飼料中檢測(cè),結(jié)果如表1所示。玉米赤霉烯酮在118批雞飼料的檢測(cè)結(jié)果為30.51%,超出標(biāo)準(zhǔn)量5.08%。大雞料的檢測(cè)結(jié)果為167.78 μg/kg,屬檢測(cè)結(jié)果最大值,蛋雞料檢測(cè)結(jié)果為28.18 μg/kg,屬檢測(cè)結(jié)果最小值。
表1 雞飼料中玉米赤霉烯酮檢測(cè)結(jié)果
通過高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法可以快速檢測(cè)出飼料及原料中玉米赤霉烯酮的含量,是一種高效的檢測(cè)方法。