劉承貴，王 凱，李仕外，唐文雙，韓忠耀*

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州 都勻 558000；2.浙江新和成股份有限公司，浙江 紹興 312500)

根瘤菌[1-3]在豆科植物與非豆科植物中，通常起固氮增肥，促進(jìn)植物體、中藥材生長及二次代謝產(chǎn)物積累功能。貴州特色民族藥水冬瓜根皮，來源于山茱萸科植物有齒鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的干燥根皮，別名水五加、大接骨丹等[4]，在對水冬瓜根皮藥材野外調(diào)查采樣過程中，發(fā)現(xiàn)部分區(qū)域分布的水冬瓜根部，發(fā)生與大豆根瘤菌共生的情況[5]，如貴州都勻小圍寨窯洞附近農(nóng)舍與山腳處，水冬瓜根部大量有根瘤菌的存在情況，結(jié)瘤部位主要為側(cè)根。目前，有關(guān)山茱萸科植物有齒鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的研究以用藥部位根皮部位為主、樹皮為輔，根皮中含有紫丁香苷[6-7]、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、黃芪苷、β-谷甾醇、硬脂酸、軟脂酸、10-Griselinosidic acid等[8-10]，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，山茱萸科植物有齒鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu樹皮部位具有較好的免疫抑制[11-12]、抗炎鎮(zhèn)痛[13]等活性，同時(shí)，課題組前期對山茱萸科植物有齒鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu根皮部位進(jìn)行了提取工藝優(yōu)化[14]、質(zhì)量控制[15-16]研究等。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，有關(guān)共生根瘤菌對水冬瓜根皮二次代謝產(chǎn)物的積累及藥材質(zhì)量的影響與評價(jià)，尚無相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法、紫外-可見分光光度法對該藥二次代謝產(chǎn)物積累狀況開展相關(guān)研究，并采用烘干法測定浸出物含量，以期揭示根瘤菌對水冬瓜根皮藥材質(zhì)量的影響。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)，Agilent Cary 100紫外-可見分光光度計(jì)(美國安捷倫科技公司)，電子天平(FA1004B，溫州瑞昕儀器有限公司)，Sartorius BT25S電子天平(十萬分之一，德國塞多利斯公司)，101-3AB型烘箱等。

1.2 試藥

紫丁香苷對照品(購自北京盛世康普化工技術(shù)研究院，批號：161214)，蘆丁對照品(購自成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-17122001)，乙腈(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純)，磷酸(分析純，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司)，水為娃哈哈純凈水(浙江娃哈哈集團(tuán)有限公司)，亞硝酸鈉(分析純，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司，批號：20130307)，硝酸鋁(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20170718)，氫氧化鈉((分析純，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司，批號為20160101)，其他試劑均為分析純。

水冬瓜根皮藥材、共生根瘤菌水冬瓜根皮藥材均為自采，采集地點(diǎn)為貴州省都勻小圍寨窯洞區(qū)域，自采藥材經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校趙鴻賓副教授鑒定為山茱萸科植物有齒鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的根皮。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液提取

將自采同株水冬瓜根皮藥材根瘤菌部位與正常部位，烘箱烘干后的藥材，各取6份，每份約0.50 g，精密稱定后，記錄稱樣量，置于圓底燒瓶中，每份加入甲醇50 mL，每份樣品回流提取1 h，定性濾紙過濾于50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 紫丁香苷含量測定方法

2.2.1 色譜條件[7]Agela Promosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長220 nm，進(jìn)樣量5 μL，柱溫35 ℃，體積流量1.0 mL·min-1，流動(dòng)相為0.50%-磷酸溶液(A)-乙腈(C)，流動(dòng)相洗脫條件見表1，保留時(shí)間為30 min。

表1 高效液相色譜流動(dòng)相洗脫條件

2.2.2 對照品溶液的制備 取紫丁香苷對照品約8.60 mg，精密稱定，加入于50 mL量瓶中，取分析純甲醇適量，超聲溶解，再加入甲醇稀釋到刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.172 0 mg·mL-1的紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液[14]。

2.2.3 供試品溶液 取“2.1”項(xiàng)下各供試品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，續(xù)濾液置于液相小瓶中，即得HPLC分析用各供試品溶液。精密吸取對照品溶液、供試品溶液各5 μL，按照《中華人民共和國藥典》(2015版四部，0512高效液相色譜法測定)[16]。

圖1 對照品(A)與樣品(B) HPLC色譜

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，用分析純甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.2.1”項(xiàng)操作。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)作線性回歸方程，得到紫丁香苷線性回歸方程為Y=7 911.4X-12.736(r2=0.999 2)，線性范圍為0.034 4～0.516 0 mg·mL-1。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[7]，測定結(jié)果見表2，由表2可知，儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[7]，測定結(jié)果見表2，由表2可知，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[7]，測定結(jié)果見表2，由表2可知，該方法重復(fù)性良好。

表2 方法學(xué)考察結(jié)果 (n=6，%)

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[7]，測得樣品平均加樣回收率為100.43%，且RSD為1.98%，說明建立的方法回收率較好。

2.2.9 含量測定 精密吸取各供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，含量測定結(jié)果見表3。

表3 紫丁香苷含量檢測結(jié)果

2.3 總黃酮含量測定方法

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[14]取蘆丁對照品約18 mg，精密稱量，移置到50 mL量瓶內(nèi)，加稀乙醇約為量瓶容積的1/3量，超聲溶解后，再加入稀乙醇適量，稀釋到刻度，搖勻，即得0.361 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，用稀乙醇稀釋到刻度，搖勻。按照文獻(xiàn)[14]方法進(jìn)行預(yù)處理，即可。在510 nm最大吸收波長下，稀乙醇空白調(diào)零，以蘆丁質(zhì)量濃度(C值)為橫坐標(biāo)，吸光度(A值)為縱坐標(biāo)作A-C標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蘆丁線性回歸方程為A=1.375 3C+0.000 24(r2=0.998 4)，結(jié)果表明蘆丁濃度在0.072 2～1.083 0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 供試品溶液的制備及預(yù)處理 按“2.1”項(xiàng)操作，制得供試品溶液后，每份樣品，精密移取1 mL于10 mL量瓶中，按照文獻(xiàn)[14]方法進(jìn)行預(yù)處理，依次用5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、4%氫氧化鈉溶液，依次進(jìn)行波長衍生化后，即得總黃酮含量測定供試品溶液，備用。

2.3.3 方法學(xué)考察 參照文獻(xiàn)[7]，測定結(jié)果見表2，由表2可知，儀器精密度和重復(fù)性良好，樣品在2 h內(nèi)穩(wěn)定性較好，可以滿足總黃酮含量測定檢測時(shí)限要求。

2.3.4 總黃酮含量測定 分別取“2.3.2”項(xiàng)下各供試品溶液，用Agient Cary 100紫外-可見分光光度計(jì)在510 nm 處分別檢測各樣品總黃酮含量，檢測結(jié)果見表4。

表4 總黃酮含量檢測結(jié)果

2.4 浸出物含量測定

按《中華人民共和國藥典》(2015版，四部“2201浸出物測定法”)[17]與課題組前期研究基礎(chǔ)篩選的浸出物測定方法[18]，對水冬瓜瓜根皮正常品與根瘤菌樣品進(jìn)行浸出物含量測定，結(jié)果見表5。

表5 浸出物含量測定結(jié)果 (%)

2.5 含量測定結(jié)果分析

由表3、表4、表5可知，同株水冬瓜根瘤菌樣本與正常樣本二次代謝產(chǎn)物以紫丁香苷與總黃酮為指標(biāo)評價(jià)相比較時(shí)，紫丁香苷平均含量分別為2.56 mg/g、0.51 mg/g，降低約5.02倍；總黃酮平均含量分別為0.062 9 μg/g、0.015 2 μg/g，降低約4.14倍。正常品浸出物測定結(jié)果無顯著性差異，而根瘤菌樣品波動(dòng)較大，有顯著性差異。結(jié)果表明：水冬瓜根皮藥材與根瘤菌共生時(shí)，可極大降低其二次代謝產(chǎn)物含量，對該藥材二次代謝產(chǎn)物有不良影響。

3 討論

檢測二次代謝產(chǎn)物總黃酮時(shí)，首先要確定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液最大吸收波長。在200～800 nm波長下進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收波長為510 nm，因此，將510 nm確定為最大吸收波長。

考察根瘤菌共生對同株藥材二次代謝產(chǎn)物影響過程中，與常規(guī)對共生植株起增加二次代謝產(chǎn)物含量或促進(jìn)植物體生長積極作用相反，研究結(jié)果表明：同株共生根瘤菌大幅降低水冬瓜根皮藥材植物體二次代謝產(chǎn)物含量。同時(shí)，尚可通過指紋圖譜技術(shù)[19-21]，通過比較正常品藥材構(gòu)建的指紋圖譜對照圖譜與根瘤菌病變藥材的相似度，來對藥材進(jìn)行整體性質(zhì)量評價(jià)，相關(guān)研究有待進(jìn)一步深入開展。

綜上所述，根瘤菌顯著降低了水冬瓜根皮藥材中總黃酮、紫丁香苷的含量，而對浸出物結(jié)果影響不具有代表性意義，部分根瘤菌樣本浸出物含量高于正常部位。由于該藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究相對薄弱，根瘤菌對其他二次代謝產(chǎn)物的影響情況，在物質(zhì)基礎(chǔ)研究基礎(chǔ)上，有待進(jìn)一步深入研究與考察。