丁玉梅，侯思名，姚春馨，楊加珍，謝俊俊，曾亞文，楊正安*

(1 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，昆明 650205；2 云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650205；3 昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650214；4 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，昆明650201)

黑籽南瓜(CucurbitaficifoliaBouche.)是葫蘆科南瓜屬一年或多年生草本藤蔓性植物，是一種具有多種抗性遺傳性狀的優(yōu)異種質(zhì)資源，其對(duì)低溫、干旱、貧瘠土壤等逆境脅迫有較強(qiáng)的抗性或耐性，對(duì)瓜類枯萎病高抗甚至免疫，已作為嫁接砧木有效控制了瓜類枯萎病的發(fā)生和危害[1]?？菸∈怯社犳邔偌怄哏牭毒?Fusariumoxysporum)寄生引起的一種真菌土傳病害，病原菌通過(guò)堵塞導(dǎo)管和分泌有毒物質(zhì)為害寄主，造成葉片萎蔫或全株枯萎死亡[2]，數(shù)年來(lái)嚴(yán)重影響瓜類栽培的產(chǎn)量和品質(zhì)，培育抗病品種是實(shí)現(xiàn)瓜類枯萎病綠色、高效防控的根本途徑，瓜類抗病種質(zhì)篩選和抗病基因資源的挖掘顯得尤為重要。

植物在長(zhǎng)期應(yīng)對(duì)各種病原菌脅迫的過(guò)程中，進(jìn)化出可以特異性識(shí)別病原菌效應(yīng)因子的抗性基因(蛋白)。研究發(fā)現(xiàn)，盡管病原分泌的效應(yīng)因子眾多，但多數(shù)植物抗病基因的結(jié)構(gòu)很保守，根據(jù)抗病蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以將抗病基因分為5類[3]：富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)的跨膜受體蛋白基因、富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)的蛋白激酶基因、絲氨酸/蘇氨酸激酶基因、毒素還原酶基因，以及核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富亮氨酸重復(fù)(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat，NBS-LRR)抗病蛋白基因。NBS-LRR類基因是植物基因組中含抗病基因數(shù)目較大的基因家族，其結(jié)構(gòu)域高度保守。核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide binding site，NBS)可與ATP或GTP蛋白結(jié)合，如ATP合成的β亞基、核糖體延伸因子，參與抗病信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗病作用[4-5]，也對(duì)抗病蛋白的活性開(kāi)關(guān)起至關(guān)重要的作用[6]。富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)(leucine-rich repeat，LRR)中的亮氨酸呈規(guī)律性重復(fù)出現(xiàn)，具有宿主與病原菌的特異性識(shí)別特性[7]，LRR結(jié)構(gòu)域也可與N端區(qū)域互作，使抗病蛋白保持失活狀態(tài)[8]。NBS類抗病基因及其抗病分子機(jī)制研究一直是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)，最近又從禾本科重要作物中分離鑒定了NBS類抗病基因，如小麥(Triticumaestivum)的抗條銹病TaRGA9等[9]和水稻(Oryzasativa)的抗稻瘟病Pi-kf2(t)基因等[10]。已從葫蘆科其他瓜類作物中獲得了一些NBS類抗病基因同源序列，如黃瓜[11](Cucumissativus)、中國(guó)南瓜[12](Cucurbitamoschata)、西瓜[13](Citrulluslanatus)、甜瓜[14](Cucumismelo)和瓠瓜[15](Lagenariasicerariavar.hispida)，由于瓜類較難進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，很少開(kāi)展基因功能的驗(yàn)證研究。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是利用帶有目的基因的病毒載體侵染植物，隨著病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄特異性誘導(dǎo)同源基因mRNA降解或被甲基化修飾，引起表型或生理改變，從而實(shí)現(xiàn)基因功能鑒定，近年來(lái)已成為模式植物和不適于遺傳轉(zhuǎn)化植物的基因功能快速鑒定的工具之一[16]。

前期已在云南黑籽南瓜基因組克隆到一個(gè)NBS類抗病基因同源片段HQRGA2 (GenBank ID：MG946756)[17]，通過(guò)枯萎病菌脅迫下的RNA-seq結(jié)果，鑒定出差異表達(dá)的HQRGA2的全長(zhǎng)基因CfRFN2(GenBank ID：MK618462)。本研究利用相應(yīng)克隆載體及生物信息學(xué)手段，對(duì)黑籽南瓜NBS類基因CfRFN2進(jìn)行分離克隆，并采用VIGS技術(shù)對(duì)其功能進(jìn)行初步驗(yàn)證，研究結(jié)果可為黑籽南瓜更多優(yōu)異基因的克隆和功能驗(yàn)證奠定前期基礎(chǔ)，對(duì)黑籽南瓜抗病分子機(jī)制研究、抗病基因資源的挖掘，以及瓜類作物抗病分子育種具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

以云南黑籽南瓜為材料，種子在10% H2O2中浸泡1 h后，28 ℃恒溫箱中催芽，待種子露白后，播種于穴盤中，于植物生長(zhǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃，光照16 h/d)。采集真葉功能葉片，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱用于RNA提取。

VIGS體系共轉(zhuǎn)化載體pTRV1、白化載體pTRV2-PDS和pTRV2的VIGS克隆載體購(gòu)自武漢天問(wèn)生物科技公司。pTRV2載體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄參照天根生化科技有限公司(北京)總RNA提取試劑盒RNApre Pure提取黑籽南瓜葉片總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIANScript Ⅱ RT Kit)合成cDNA模板。

1.2.2CfRFN2基因的克隆在二代RNA-seq獲得CfRFN2基因全長(zhǎng)序列的基礎(chǔ)上，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)引物(表1)，分3段拼接序列克隆該基因，在QC-R2和QC-F3、QC-R3和QC-F4中引入EcoRⅠ和BglⅡ酶切位點(diǎn)。以cDNA為模板PCR擴(kuò)增3個(gè)片段，擴(kuò)增體系為：cDNA模板5 μL，10×緩沖液 5 μL，dNTP(10 mmol·L-1)1 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，KOD聚合酶1 μL(1 U·μL-1)，補(bǔ)ddH2O到50 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增的片段克隆到pEASY-T1載體中，送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，序列用DNASTAR軟件進(jìn)行全長(zhǎng)基因拼接。

圖1 pTRV2載體圖Fig.1 The map of vector pTRV2

1.2.3CfRFN2核苷酸序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析將克隆的CfRFN2基因序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上比對(duì)驗(yàn)證。使用DNASTAR軟件將cDAN翻譯為氨基酸序列尋找開(kāi)放閱讀框(ORF)，用Conserved domains detect分析CDS保守結(jié)構(gòu)域，核苷酸相似性分析Clustal W(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/)在線進(jìn)行。選取14條已知的NBS類抗病蛋白和6條瓜類NBS抗病蛋白序列作為參照序列，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4CfRFN2組織表達(dá)特性分析提取正常生長(zhǎng)植株中的根、莖、葉片和果皮中的總RNA，并按反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，每種組織3次重復(fù)。以表2中的NBS1F和NBS1R為CfRFN2引物進(jìn)行qRT-PCR，Actin基因作為內(nèi)參基因，引物為ActinF和ActinR。qRT-PCR 采用CHamQ qPCR Master Mix試劑盒，反應(yīng)體系10 μL為：2×緩沖液5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和Excel 2016軟件作圖，不同組織間采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

表1 用于克隆黑籽南瓜CfRFN2基因的擴(kuò)增引物

表2 黑籽南瓜CfRFN2的VIGS載體構(gòu)建、測(cè)序及驗(yàn)證引物

1.2.5 含CfRFN2基因的VIGS載體構(gòu)建1)目的片段的擴(kuò)增 以帶有CfRFN2片段3的質(zhì)粒pEASY-T1-A2-3為模板，引物18OV78-F/R(表2)擴(kuò)增415 bp的目標(biāo)片段構(gòu)建VIGS載體pTRV2-CfRFN2。擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系為：DNA模板1 μL，10×緩沖液 5 μL，dNTP Mixture(10 mmol·L-1)1 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，KOD聚合酶 1 μL(1U·μL-1)，加ddH2O到50 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，68 ℃延伸 2 min，32個(gè)循環(huán)，68 ℃延伸5 min。

2) pTRV2-CfRFN2構(gòu)建和驗(yàn)證 利用pTVR2中的多克隆位點(diǎn)，用SacⅠ與BamHⅠ雙酶切目的片段與pTRV2載體，酶切體系為：CfRFN2目的片段或pTRV2 質(zhì)粒載體30 μL；10×緩沖液 10 μL；SacⅠ2 μL；BamHⅠ2 μL，加ddH2O 56 μL到100 μL，37 ℃孵育 3 h?；厥漳康钠魏洼d體片段后進(jìn)行連接，反應(yīng)體系為：CfRFN2片段7 μL；pTRV2 載體1 μL；10×緩沖液 1 μL；T4DNA 連接酶1 μL。混合后16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落到LB/Kan+液體培養(yǎng)基中進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證(引物18OV82-R和PTRV2-SEQE)，選5個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序后提取質(zhì)粒。

3) 載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101及驗(yàn)證 將VIGS載體pTRV2-CfRFN2、共轉(zhuǎn)化載體pTRV1、白化載體pTRV2-PDS通過(guò)凍融法分別轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101細(xì)胞中。挑取轉(zhuǎn)化單菌落到Y(jié)EB/Kan+和Rif+液體培養(yǎng)基中，菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌株(CfRFN2Q1F/R)。

1.2.6 含VIGS載體的農(nóng)桿菌侵染黑籽南瓜植株1)農(nóng)桿菌VIGS菌液的制備 接種前2 d，將含有不同載體(pTRV1、pTRV2-PDS和pTRV2-CfRFN2)的農(nóng)桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.8。以1∶50體積轉(zhuǎn)接到含200 mmol·L-1乙酰丁香酮(AS)和 10 mmol·L-1嗎啉乙磺酸(MES)的 YEB培養(yǎng)基中，28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后離心，菌體重懸于MMA懸浮液(MS+200 mmol·L-1AS+10 mmol·L-1MES+20 g·L-1蔗糖)至OD600值為1.0。

2) 農(nóng)桿菌侵染黑籽南瓜植株 將pTRV1、pTRV2載體及pTRV2衍生的載體按照1∶1體積比混勻。分為3組接種：空載組pTRV1+pTRV2；白化組：pTRV1+pTRV2-PDS；沉默組：pTRV1+pTRV2-CfRFN2。當(dāng)黑籽南瓜幼苗長(zhǎng)出兩葉一心時(shí)，用10 μL移液槍頭在葉片背面摩擦形成1～2 mm的圓形破損組織，對(duì)準(zhǔn)破損部位推動(dòng)不帶針頭的無(wú)菌注射器(1 mL農(nóng)桿菌菌液)，使葉片表皮下覆蓋浸潤(rùn)狀菌液。農(nóng)桿菌侵染后的黑籽南瓜幼苗置于25 ℃光照培養(yǎng)4周，每個(gè)組3株，3次重復(fù)。

1.2.7 黑籽南瓜植株中TRV病毒檢測(cè)CTAB法提取黑籽南瓜植株基因組DNA。PCR檢測(cè)TRV1和TRV2的引物為RNA1F/R和RNA2F/R，檢測(cè)pTRV2-CfRFN2的引物為CfRFNQ1F/R和CfRFNQ2F/R。

1.2.8 黑籽南瓜植株接種枯萎病菌及病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)以轉(zhuǎn)CfRFN2沉默組植株培養(yǎng)4周后接種枯萎病菌為處理，野生型植株相同條件下培養(yǎng)4周時(shí)接種枯萎病菌為正對(duì)照，用傷根加灌根法接種枯萎病菌[18]。幼苗病情分級(jí)在接種7 d后進(jìn)行。病情分級(jí)參考黃瓜枯萎病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[19]。病情指數(shù)= [∑(各級(jí)病株數(shù)×對(duì)應(yīng)各級(jí)值)/(調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最高級(jí)值)]×100。

1.2.9CfRFN2基因沉默植株的qRT-PCR分析qRT-PCR檢測(cè)接種枯萎病菌后2 和4 d的CfRFN2基因沉默植株和接種后的野生型植株葉片中的CfRFN2表達(dá)量(CfRFNQ1F/R)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑籽南瓜CfRFN2基因的克隆及序列分析

設(shè)計(jì)的3對(duì)引物分別從黑籽南瓜cDNA擴(kuò)增出預(yù)期的片段1、片段2和片段3，長(zhǎng)度分別為1 341、1 801 和998 bp。將這3片段分別連入克隆載體pEASY-T1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒后，PCR驗(yàn)證后進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)序列測(cè)定正確后，采用DNASTAR軟件進(jìn)行序列拼接，得到CfRFN2基因全長(zhǎng)為4 303 bp，ORFfinder預(yù)測(cè)的ORF為4 092 bp，編碼1 363個(gè)氨基酸殘基，CfRFN2的GenBank登錄號(hào)為MK618462。對(duì)1 363個(gè)氨基酸序列進(jìn)行保守域分析發(fā)現(xiàn)，CfRFN2基因含有1個(gè) NB-ARC保守結(jié)構(gòu)域和2個(gè)LRR 結(jié)構(gòu)域，屬于典型的NBS類基因。用GO(Gene Ontology，GO)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CfRFN2進(jìn)行注釋，該基因注釋為擬南芥抗病蛋白At4g27190類轉(zhuǎn)錄體X1的同源基因。

通過(guò)在線的親/疏水性分析(http://cn.expasy.org/cgi-in/protscale.pl)，獲得CfRFN2的部分肽鏈的親/疏水性分布曲線，發(fā)現(xiàn)該基因的部分肽鏈存在較大范圍的親水區(qū)，有較強(qiáng)的親水性，屬于可溶性蛋白。用Signal P-信號(hào)肽預(yù)測(cè)工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)分析該基因的信號(hào)肽序列位置可能在19～20個(gè)氨基酸之間。

2.2 CfRFN2的核苷酸相似性分析

CfRFN2與其他瓜類抗病基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示核苷相似性在87%～98%之間，其中與美洲南瓜(Cucurbitapepo)的RPS2類(XM_023691176.1)抗病蛋白基因核苷酸相似性最高達(dá)98%，得分為7 070 bits；與印度南瓜(Cucurbitamoschata)RPS2類(XM_023141784.1)和中國(guó)南瓜(Cucurbitamaxima)RPS2類(XM_023073871.1)的抗病蛋白基因相似性均為97%，得分分別為7 101和7 055 bits；與甜瓜(Cucurbitamelo)At4g27190類(XM_017044036.1)和黃瓜(Cucumissativus)At4g27190類(XM_011650710.1)的抗病基因相似性都為87%，得分分別為4 663和4 615 bits。

2.3 CfRFN2系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將CfRFN2與14條已知物種抗病基因或序列和6條其他瓜類NBS類抗病基因的蛋白序列導(dǎo)入MEGA7.0，共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖2可以看出，這些NBS類抗病蛋白可以分為3大類群。第一大類群包括7條瓜類NBS類抗病蛋白和亞麻抗病蛋白L6；第二大類群包括擬南芥抗病蛋白R(shí)PP13和NB-ARC蛋白、小麥L10抗病蛋白、番茄抗病蛋白Hero、水稻NBS-LRR蛋白、Pib蛋白、Nbs4-Pi蛋白；第三大類群包括擬南芥RPS4蛋白和RPP1蛋白、水稻Pita抗病蛋白和Xa1、番茄抗病蛋白Prf、玉米R(shí)P1抗病蛋白。值得關(guān)注的是，第一大類群中的NBS類抗病蛋白可分為2個(gè)分支，7條瓜類NBS類抗病蛋白聚為一個(gè)分支，另一個(gè)分支為亞麻抗病蛋白L6，說(shuō)明瓜類NBS類抗病蛋白與亞麻抗病蛋白L6的親緣關(guān)系比與其余2大類群的親緣關(guān)系近，瓜類的7條NBS抗病蛋白親緣關(guān)系較近且進(jìn)化出現(xiàn)時(shí)間較晚。從瓜類的這7條抗病蛋白來(lái)看，CfRFN2抗病蛋白與中國(guó)南瓜和美洲南瓜抗病蛋白的RPS2、印度南瓜RPS2-like親緣關(guān)系最近，其次是黃瓜的At4g27190和苦瓜的At4g27220，與甜瓜中的抗病蛋白Atg27190親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，說(shuō)明了黑籽南瓜和南瓜屬其他瓜類作物之間同屬不同種的近緣親緣關(guān)系，同時(shí)也表明CfRFN2可能是一個(gè)功能性的抗病基因。CfRFN2抗病蛋白進(jìn)化上出現(xiàn)時(shí)間晚于黃瓜和甜瓜的At4g27190以及苦瓜的Atg27220，且更晚于其他物種的NBS類抗病蛋白，說(shuō)明其進(jìn)化速度較快，這可能是黑籽南瓜抗性比其他瓜類強(qiáng)的原因之一。

2.4 CfRFN2的組織表達(dá)特性分析

CfRFN2基因在黑籽南瓜植株不同組織中的表達(dá)量結(jié)果(圖3)顯示，CfRFN2基因主要是在葉片組織中高量表達(dá)，其次是莖中，再次是深色果皮組織和根，表達(dá)量最低的是淺色果皮組織。

圖2 黑籽南瓜CfRFN2基因與其他物種NBS抗病蛋白的進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenic tree of the deduced protein of CfRFN2 from C. ficifolia with the known disease resistance proteins

2.5 VIGS載體pTRV2-CfRFN2構(gòu)建

以帶有CfRFN2片段3的質(zhì)粒pEASY-T1-A2-3為模板對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增(圖4)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為415 bp。對(duì)目的片段進(jìn)行回收，與酶切后的載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，完成沉默載體pTRV2-CfRFN2構(gòu)建，菌落PCR檢測(cè)重組子擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。構(gòu)建完成后轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101用于黑籽南瓜侵染。

2.6 VIGS載體轉(zhuǎn)化黑籽南瓜的體系有效性驗(yàn)證

選取長(zhǎng)勢(shì)良好，葉片無(wú)破損的幼苗進(jìn)行摩擦注射接種，侵染完成后，將植株幼苗于28 ℃、16 h光照、8 h黑暗環(huán)境下生長(zhǎng)，3周后白化組植株開(kāi)始出現(xiàn)白化現(xiàn)象，4周后黑籽南瓜植株下部葉片白化明顯，但新生葉片白化不明顯，而空載組生長(zhǎng)正常，說(shuō)明整個(gè) VIGS 侵染體系對(duì)黑籽南瓜有效，但侵染僅發(fā)生在前期(圖5)。

Y. 葉片; G. 根; J. 莖; P-1. 深色果皮; P-1q. 淺色果皮； 不同小寫(xiě)字母表示不同組織間的差異顯著性(P<0.05)圖3 CfRFN2基因在黑籽南瓜不同組織中的表達(dá)特性Y. Leaf; G. Root; J. Stem; P-1. Dark rind of fruit; P-1q. Light rind of fruit； Different normal letters mean significant differences at 0.05 levelFig.3 Expression characteristics of CFRFN2 gene in different tissues of C. ficifolia

2.7 VIGS載體轉(zhuǎn)化黑籽南瓜植株的PCR檢測(cè)

以特異引物RNA1F/R和RNA2/R對(duì)空載組和白化組植株葉片進(jìn)行病毒PCR檢測(cè)，結(jié)果(圖6和圖7)表明，空白組和白化組植株分別擴(kuò)增出640 和420 bp的目的條帶。以特異引物CfRFNQ1F/R和CfRFNQ2F/R對(duì)沉默組進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果(圖8)顯示，轉(zhuǎn)pTRV2-CfRFN2 的沉默組植株中擴(kuò)增出208 和188 bp的特異性條帶。以上結(jié)果說(shuō)明TRV病毒和CfRFN2基因片段成功導(dǎo)入黑籽南瓜。

2.8 轉(zhuǎn)pTRV2-CfRFN2沉默植株抗病性和qRT-PCR分析

以pTRV1和pTRV2-CfRFN2共侵染4周后的黑籽南瓜幼苗接種枯萎病菌為處理，以野生型植株培養(yǎng)4周后接種枯萎病菌為正對(duì)照，野生型植株為負(fù)對(duì)照，接種7 d后植株生長(zhǎng)見(jiàn)圖9。病情指數(shù)分析表明，7 d后CfRFN2 沉默植株較正常對(duì)照發(fā)病嚴(yán)重，其平均病情指數(shù)(37.80)比正對(duì)照(28.60)高，為正對(duì)照的1.32倍。從病癥表現(xiàn)看，CfRFN2 沉默植株多數(shù)葉片和葉邊緣黃化明顯，莖葉輕微下垂，莖部有壞死斑；而正對(duì)照植株則莖葉只有輕微黃化，莖部無(wú)壞死斑；負(fù)對(duì)照野生型植株則生長(zhǎng)正常。接種枯萎病菌2 d后CfRFN2基因相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照下降34.75%，至4 d時(shí)表達(dá)量下降98.27%，均達(dá)到了顯著水平(圖10)。以上結(jié)果初步表明，通過(guò)VIGS技術(shù)初步驗(yàn)證黑籽南瓜CfRFN2基因具有抗枯萎病的作用。

M. DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) (100 bp～10 kb)；CK. 陰性對(duì)照；1. CfRFN2圖4 黑籽南瓜CfRFN2基因片段3中目的片段的擴(kuò)增M. DNA Marker(100 bp-10 kb); CK. Negative control; 1. CfRFN2Fig.4 PCR amplification of vector-used sequence in CfRFN2 fragment 3 of C. ficifolia

圖5 黑籽南瓜被帶有pTRV2-PDS和pTRV1農(nóng)桿菌共侵染后的白化表型Fig.5 Albino phenotype performance of C. ficifolia infected by Agrobacterium carrying vector pTRV2-PDS and pTRV1

1.陰性對(duì)照；2. pTRV1質(zhì)粒；3-6. pTRV1侵染植株圖6 pTRV1載體轉(zhuǎn)化黑籽南瓜的PCR驗(yàn)證1. Negative CK; 2. Plasmid of pTRV1; 3-6. Transformed plants by pTRV1Fig.6 PCR verification of pTRV1 vector transformated plants of C. ficifolia

1. pTRV2 vector；2-5. pTRV2-PDS侵染植株；6. 對(duì)照?qǐng)D7 pTRV2-PDS載體轉(zhuǎn)化黑子南瓜植株P(guān)CR驗(yàn)證1. pTRV2 vector；2-5. Infected plants with pTRV2-PDS；6. CKFig.7 PCR verification of pTRV2 vector transformated plants of C. ficifolia

M.DL2000，1. 引物CfRFNQ1F、CfRFNQ1R檢測(cè)； 2.引物CfRFNQ2F、CfRFNQ2R檢測(cè)；CK. 野生型植株圖8 沉默載體pTRV2-CfRFN2侵染黑籽 南瓜植株的PCR檢測(cè)M. DL2000； 1. CfRFNQ1F, CfRFNQ1R； 2. CfRFNQ2F, CfRFNQ2R； CK. Wild typeFig.8 PCR verification of transformed plants of C. ficifolia by silencing vector pTRV2-CfRFN2

*表示與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05) 圖10 枯萎病菌接種黑籽南瓜植株(CfRFN2沉默)中的 CfRFN2基因qRT-PCR檢測(cè)* represents significant difference compared with CK (P<0.05)Fig.10 CfRFN2 expression detection of VIGS plants of C. ficifolia infected by wilt fungi

圖9 黑籽南瓜植株的CfRFN2基因通過(guò)VIGS沉默后接種枯萎病菌的發(fā)病表型Fig.9 The performance of C. ficifolia plants infected by F. oxysorum after CfRFN2 gene silencing via VIGS system

3 討 論

植物-病原菌互作是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，在應(yīng)對(duì)病原菌效應(yīng)因子的入侵方面，植物進(jìn)化出能特異性識(shí)別效應(yīng)因子的抗病蛋白，激活效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫響應(yīng)，導(dǎo)致局部細(xì)胞的程序性死亡，引起宿主植物的過(guò)敏反應(yīng)，更為有效地抵抗病原菌的入侵[20]。研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)抗病基因(蛋白)的結(jié)構(gòu)較為保守， 而NBS類基因是目前克隆到的抗病基因中數(shù)量最多的基因家族。在典型的NBS類抗病蛋白中，NBS結(jié)構(gòu)域相對(duì)保守，而LRR結(jié)構(gòu)域具有多樣性[7]。NBS結(jié)構(gòu)域?qū)τ诰S持抗性蛋白的激活或失活狀態(tài)至關(guān)重要，參與抗病信號(hào)的傳遞和觸發(fā)免疫響應(yīng)[5-6]。LRR結(jié)構(gòu)域不僅能特異性識(shí)別效應(yīng)因子[7]，也能與N端區(qū)域互作，決定抗病蛋白的活性狀態(tài)，共同監(jiān)控效應(yīng)因子[21]。在NBS類抗病基因介導(dǎo)的抗病分子機(jī)制中，抗病蛋白主要通過(guò)直接作用和間接作用模式來(lái)識(shí)別效應(yīng)蛋白，前者如擬南芥的RPP1[22]；間接識(shí)別通過(guò)效應(yīng)因子對(duì)靶蛋白的攻擊或與靶蛋白類似物以及其他抗病蛋白互作激活免疫響應(yīng)，如擬南芥的抗病基因RPS5[23]和水稻的RGA4/RGA5等[24]。此外，抗病蛋白還與抗病信號(hào)傳導(dǎo)中的蛋白和病程蛋白發(fā)生互作共同調(diào)控植物免疫響應(yīng)[25-26]。本研究中的黑籽南瓜CfRFN2含有1個(gè)NBS結(jié)構(gòu)域和2個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域，LRR結(jié)構(gòu)域數(shù)量與黑籽南瓜抗病性強(qiáng)的關(guān)系值得關(guān)注，但CfRFN2抗病蛋白中的保守結(jié)構(gòu)域和LRR區(qū)域的具體功能和識(shí)別模式、是否參與抗病信號(hào)傳導(dǎo)，以及抗病蛋白是否與病程相關(guān)蛋白互作等分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

NBS類基因作為一類免疫監(jiān)測(cè)因子，在植株正常狀態(tài)下表達(dá)量很低或處于失活狀態(tài)，但其對(duì)于病原菌的入侵卻高度敏感。研究也表明，多數(shù)NBS類基因受病原菌侵染的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，如擬南芥的RPP8[27]、葡萄中的NBS-LRR類基因[28]，青稞中的HvtRGA等[29]。Gutierren等報(bào)道鷹嘴豆中的RGA基因早期受枯萎病菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[30]，我們?cè)诤谧涯瞎辖臃N枯萎病菌后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比對(duì)中，發(fā)現(xiàn)Unigene編號(hào)為CL7398Contig1恰好是我們關(guān)注的NBS類抗病同源片段HQRGA2的全長(zhǎng)基因，而該基因在接種后4 d上調(diào)表達(dá)的DEGs(differential expression genes，DEGs)中，其log2FC值達(dá)到了3.99，qRT-PCR分析結(jié)果也顯示CL7398Contig1在接種后2 和4 d都顯著上調(diào)表達(dá)[31]，說(shuō)明該基因參與了黑籽南瓜對(duì)枯萎病菌侵染的抗病應(yīng)答過(guò)程。在利用VIGS技術(shù)沉默后，CfRFN2基因沉默植株在接種枯萎病菌2 和4 d后均比對(duì)照顯著下調(diào)表達(dá)，且病情指數(shù)增加，這與蔣魯亞等報(bào)道的小麥中的NBS類基因TaRPM1沉默可以顯著降低植株對(duì)白粉病的抗病水平的結(jié)果類似[32]。組織表達(dá)特性分析表明，CfRFN2基因在根中的表達(dá)量顯著低于葉片和莖部，而枯萎病病原菌從根部浸染植物，我們?cè)谇捌诘氖覂?nèi)接種試驗(yàn)中也觀察到，用菌液灌根時(shí)，黑籽南瓜根尖變黑，產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，植株不發(fā)?。划?dāng)采用傷根加灌根法接種時(shí)，植株才部分表現(xiàn)病癥。我們從黑籽南瓜基因組中挖掘了11個(gè)NBS類關(guān)鍵抗病基因，CfRFN2基因是其中之一。綜合以上結(jié)果，推測(cè)CfRFN2蛋白參與調(diào)控黑籽南瓜植株的免疫響應(yīng)，但其對(duì)枯萎病侵染的免疫應(yīng)答機(jī)制還有待解析。

本研究用VIGS沉默技術(shù)使CfRFN2基因沉默后，黑籽南瓜植株枯萎病發(fā)病嚴(yán)重，病情指數(shù)比對(duì)照增加，VIGS沉默黑籽南瓜植株的基因相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照降低，初步驗(yàn)證了黑籽南瓜CfRFN2具有抗枯萎病的功能。有關(guān)VIGS沉默技術(shù)體系的建立，以往研究表明，病毒載體有宿主依賴性，不同的植物對(duì)VIGS沉默效率的影響較大。影響VIGS沉默效果的因素有病毒與宿主植物的相互作用及其生長(zhǎng)的環(huán)境條件[33]。迄今，應(yīng)用于葫蘆科作物上的病毒載體只見(jiàn)基于蘋(píng)果潛隱球形病毒(apple latent spherical virus，ALSV)[34]和煙草環(huán)斑病毒(tobacco ringspot virus，TRSV)構(gòu)建的VIGS載體[35]。本研究采用的是煙草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)載體，黑籽南瓜植株葉片在接種含有pTRV-PDS載體的農(nóng)桿菌后，僅有下部的葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象，而在新生葉中白化并不明顯。PCR擴(kuò)增表明，pRNA1和pRNA2已轉(zhuǎn)入黑籽南瓜葉片中，說(shuō)明TRV病毒系統(tǒng)可以侵染黑籽南瓜，但侵染效率不高。當(dāng)然，插入片段與目的基因的同源性[36]、環(huán)境溫度[37]、插入片段的長(zhǎng)度[38]、侵染方式[39]和植株的生育期[40]等對(duì)沉默效率有較大的影響。本研究利用TRV載體的VIGS技術(shù)，qRT-PCR檢測(cè)表明CfRFN2沉默植株中表達(dá)量比對(duì)照減低，表現(xiàn)出一定沉默效果，但還需要篩選適于黑籽南瓜高效侵染的病毒和優(yōu)化VIGS沉默條件，以進(jìn)行更多基因的VIGS驗(yàn)證。此外，還需在感病瓜類作物上(如黃瓜和西瓜)開(kāi)展穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證CfRFN2基因的功能，其是否具有抗其他瓜類病害(如霜霉病)的功能也需進(jìn)一步探索。本研究中NBS類抗病基因CfRFN2的克隆和VIGS驗(yàn)證為黑籽南瓜更多優(yōu)異基因的克隆和功能驗(yàn)證奠定了前期基礎(chǔ)，也為發(fā)掘利用黑籽南瓜優(yōu)異抗病基因和開(kāi)展瓜類分子育種提供了新信息。