付 金，姚秋萍，鄧水秀，譚承建

(貴州民族大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，貴州貴陽550025)

皂角米又稱皂角仁、皂角精，是皂莢的種子，含有半乳甘露聚糖［1］，是一種高蛋白、低糖、氨基酸齊全和礦質(zhì)元素豐富，符合高K低Na飲食結(jié)構(gòu)的營(yíng)養(yǎng)保健食物［2］。此外，皂角還有一定的生物活性。如抗菌活性、殺蟲活性、抗病毒活性等［3］。楊向穎等［4］從皂莢中分離出一種具有殺鼠活性的三萜皂苷。Dai等［5］發(fā)現(xiàn)皂角70%乙醇提取物具有抗過敏和抗炎活性。Peng等［6］研究皂角果提取物，發(fā)現(xiàn)其可以通過抗高血脂活性有效地減輕動(dòng)脈粥樣硬化，具有治療高脂血癥相關(guān)的心血管疾病的治療潛力。

近年來，皂角多糖資源的開發(fā)利用受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注，余銘等［7］用皂角米多糖溶液涂膜對(duì)比PE膜包裝處理對(duì)甜柿果果仁貯藏保鮮效果的研究發(fā)現(xiàn)，皂角米多糖具有類似PE膜包裝的保鮮效果，可作為一種新型的果實(shí)涂膜保鮮材料。Gao等［8］用皂角米多糖合成熱敏接枝聚合物，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。Hou等［9］通過美拉德反應(yīng)，用酶蛋白疏水肽對(duì)皂角多糖進(jìn)行疏水改性，制備了一種新型的皂角膠基乳化劑。Pradeep等［10］報(bào)道了皂角多糖具有抗大鼠糖尿病及其并發(fā)癥的作用。Sun等［11］報(bào)道了皂角米多糖能有效降低淀粉的消化率和葡萄糖擴(kuò)散速率，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)皂角米多糖可以降低含淀粉食品的升糖指數(shù)，并抑制餐后血糖水平的激增。皂角米多糖因具有增稠、黏合、穩(wěn)定等特點(diǎn)在食品醫(yī)藥［12］、石油鉆探［13］、造紙［14］、涂料［15］等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。多糖作為皂莢的功能性成分之一，其提取工藝以及動(dòng)力學(xué)研究在工業(yè)生產(chǎn)中尤為重要。目前已報(bào)道的皂角米多糖提取方法主要有水提醇沉、超聲波輔助提取等［16］，對(duì)于提取采用動(dòng)力學(xué)模型方面的研究未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以貴州省畢節(jié)地區(qū)的皂角米為研究對(duì)象，采用Fick第一定律建立黔產(chǎn)皂角米多糖提取動(dòng)力學(xué)模型，通過紅外分析對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，通過測(cè)定皂角米多糖對(duì)2，2－聯(lián)氮－二(3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸)二銨鹽(ABTS)、羥基自由基、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)、超氧陰離子自由基的清除能力來評(píng)價(jià)其抗氧化活性，以期為皂角米多糖的規(guī)?；崛∫约霸砬v高價(jià)值產(chǎn)品研發(fā)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皂角米 購(gòu)于貴州畢節(jié);苯酚、葡萄糖、過氧化氫、抗壞血酸、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、硫酸亞鐵、水楊酸、鹽酸、硫酸等 均為分析純;2，2－聯(lián)氮－二(3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸)二銨鹽(ABTS)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司;中性蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司。

JA5003電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;RE－2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;TDL－8M離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;FD5－3P真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)SIM;TU－1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;Nicolet6700傅里葉紅外光譜儀 上海萊?？茖W(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 皂角米多糖提取 將皂角米粉碎，過60目篩，精確稱量5.00 g于燒杯中，加入比例為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60的蒸餾水，再加入2.50 g中性蛋白酶(蛋白酶活力50000 U/g)，攪拌均勻，室溫過夜，在328、333、338、343、348、353 K下回流60、75、90、105、120、135 min，抽濾，上清液加入200 mL無水乙醇，4℃靜置過夜，4000 r/min離心獲得沉淀，沉淀用蒸餾水溶解，于－52℃下冷凍干燥24 h，即得皂角米多糖。

1.2.2 皂角米多糖含量的測(cè)定 采用苯酚－硫酸法［17］測(cè)定皂角米多糖含量。配制濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL于10 mL試管中，用蒸餾水補(bǔ)充至2 mL，沿管壁加入濃度為5%苯酚溶液1 mL，再加入5 mL濃硫酸，充分振搖，水浴10 min，靜置至室溫，于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，作皂角米多糖濃度對(duì)吸光度關(guān)系圖。得到回歸方程為:y=6.05x－0.0903，線性范圍0.05～0.25 mg/mL，決定系數(shù)R2為0.9989。量取0.1 mL皂角米多糖溶液，按照上述方法操作，以下式計(jì)算多糖含量。

其中，C為樣品溶液中多糖濃度(mg/mL);V為樣品溶液體積(mL);F為稀釋倍數(shù);M為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3 多糖提取動(dòng)力學(xué)研究 一般認(rèn)為，多糖在提取過程中分為三個(gè)過程，提取液向物料內(nèi)部滲透［18］、有效成分溶解于提取液中［19］、有效成分向皂角米表面擴(kuò)散以及由皂角米表面擴(kuò)散至主體溶劑中［20］。假設(shè)粉碎后皂角米顆粒為球形，且形狀均勻［21］，整個(gè)提取過程中形態(tài)不變，多糖成分只向同一方向擴(kuò)散，擴(kuò)散系數(shù)恒定且均相溫度保持不變［22］。設(shè)皂角米顆粒半徑為R，表面擴(kuò)散系數(shù)為Ds，由Fick第一定律得:

設(shè)提取接近平衡時(shí)提取溶液中多糖濃度為C∞，提取溶液中皂角米多糖初始濃度為C0，根據(jù)傅里葉變換求得［23］:

通常情況下，濃度的分布式為無限級(jí)數(shù)，高次項(xiàng)分布趨近于0，可忽略，上式取n=1，則

式(4)左右兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得:

式(4)、(5)為皂角米多糖提取動(dòng)力學(xué)模型，該模型反映了皂角米多糖提取過程中提取時(shí)間、提取溫度、料液比等參數(shù)對(duì)多糖濃度的影響。

1.2.4 皂角米多糖紅外光譜分析 稱取3 mg皂角米多糖與干燥的0.3 g KBr在瑪瑙研磨缽中順時(shí)針研磨2 min，壓為薄片，于紅外光譜儀中進(jìn)行光譜掃描，波數(shù)范圍為4000～400 cm－1［24］。

1.2.5 皂角米多糖抗氧化活性研究

1.2.5.1 皂角米多糖對(duì)ABTS陽離子自由基的清除活性 參照Durmaz等［25］報(bào)道的方法制備ABTS樣液，取過硫酸鉀(2.6 mmol/L)于2 mL ABTS(7.4 mmol/L)中，混勻，室溫避光靜置12 h，取5 mL上述樣液于10 mL容量瓶中，分別加入一定濃度(0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)的皂角米多糖溶液，室溫避光靜置20 min，于752 nm測(cè)定吸光度，以VC(濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)作為對(duì)照。計(jì)算公式為:

式中，A0為空白對(duì)照組，A1樣品組。

1.2.5.2 皂角米多糖對(duì)羥基自由基的清除活性 參照李粉玲等［26］報(bào)道的方法，配制0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL的皂角米多糖溶液。取以上溶液各1 mL，加入9 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水楊酸－乙醇1 mL，再加入8.8 mol/L H2O21 mL啟動(dòng)反應(yīng)，37℃水浴30 min，在510 nm處測(cè)量吸光度，以VC(濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)作為對(duì)照。計(jì)算公式為:

式中，A0為空白對(duì)照液的吸光度值;AX為加入多糖后的吸光度值;AX0為不加過氧化氫引發(fā)反應(yīng)的吸光度值。

1.2.5.3 皂角米多糖對(duì)DPPH自由基的清除活性 參照李亞輝等［27］的方法，取5 mL濃度為5 mmol/L的DPPH－無水乙醇溶液(備用液)，加入到不同濃度的多糖(濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)溶液中，振搖，室溫暗處放置30 min，于517 nm測(cè)定吸光度，以VC(濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)作為對(duì)照。計(jì)算公式為:

式中，A0為備用液的吸光度，A1為備用液和多糖的吸光度，A2為無水乙醇和多糖吸光度。

1.2.5.4 皂角米多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除活性 參考羅敬文等［28］報(bào)道的方法，取1 mL去離子水于50 mmol/L Tris－HCl緩沖液中，混合均勻，水浴(25℃)20 min，加入1.0 mL不同濃度的多糖(濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)與6 mmol/L 25℃預(yù)熱的鄰苯三酚0.1 mL，振搖混勻，水浴(25℃)5 min，加入0.5 mL 10 mmol/L HCl終止反應(yīng)。于420 nm處測(cè)定吸光值，以VC(濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)作為對(duì)照。計(jì)算公式為:

式中，K0為空白樣品的平均吸光度值，K1為式樣的平均吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次，取平均值。用Graph Pad Prism 8.0.1(244)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取動(dòng)力學(xué)模型的建立

2.1.1 提取速率常數(shù)k 由圖1可看出，皂角米多糖濃度和提取溫度、提取時(shí)間成正比關(guān)系。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到120 min后，多糖濃度變化較小，135 min后基本平衡;相同的提取時(shí)間下，提取溫度越高，多糖濃度越大;相同提取溫度下，提取時(shí)間越長(zhǎng)，析出的多糖越多，濃度越大。由圖2可看出，相同提取時(shí)間條件下，料液比越大，則多糖濃度越大，一定范圍內(nèi)，增大料液比有助于多糖提取;相同料液比條件下，提取時(shí)間越長(zhǎng)，多糖濃度越大，一定范圍內(nèi)，升高溫度有助于多糖提取。相同料液比條件下，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)120 min后，多糖濃度變化較小，135 min時(shí)基本達(dá)到平衡。在溫度為353 K，提取時(shí)間為135 min時(shí)，皂角米多糖得率為7.1%。

圖1 不同溫度條件下多糖濃度隨時(shí)間變化趨勢(shì)Fig.1 Changes of polysaccharide concentration with time under different temperature conditions

圖2 不同料液比條件下多糖濃度隨時(shí)間變化趨勢(shì)Fig.2 Variation of polysaccharide concentration with time under different material－liquid ratios

利用圖1、圖2中的變化趨勢(shì)作ln［C∞/(C∞－C)］對(duì)t的關(guān)系圖，見圖3，所得的關(guān)系曲線和表觀速率常數(shù)k見表1、表2。

由表1、表2得出，不同提取條件下的ln［C∞/(C∞－C)］與t線性關(guān)系良好，系數(shù)R2均大于0.90。表觀速率常數(shù)k與提取時(shí)間和料液比成正比。

2.1.2 相對(duì)萃余率 皂角米在提取前雖浸泡，但其溶于水中的多糖較少，可忽略。取初始濃度C0=0，設(shè)相對(duì)萃余率y=(C∞－C)/C∞，則式(5)變?yōu)閥=(6/π2)exp(－kt)。在圖1、圖2數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，作相對(duì)萃余率(C∞－C)/C∞對(duì)提取時(shí)間t關(guān)系圖(圖4)。

表1 不同提取溫度下ln［C∞/(C∞－C)］與時(shí)間t的回歸結(jié)果Table 1 Regression results between ln［C∞/(C∞－C)］and t at different temperatures

表2 不同料液比時(shí)ln［C∞/(C∞－C)］與時(shí)間t的回歸結(jié)果Table 2 Regression results between ln［C∞/(C∞－C)］and t at different solid－liquid ratios

擬合方程和速率常數(shù)見表3、表4。由表3、表4看出，擬合方程系數(shù)均在0.88以上，擬合度較好，符合指數(shù)模型。

2.1.3 活化能 由化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可知，在皂角米多糖提取過程中，其速率常數(shù)k與溫度T符合符合Arrhenius公式［29］:lnk=lnA－Ea/RT。用圖1、表1中的數(shù)據(jù)作lnk與T關(guān)系圖(見圖5)，由圖可知，lnk與T線性關(guān)系較好(R2=0.9892)。根據(jù)回歸方程計(jì)算出皂角米多糖水提過程中的活化能Ea=1807×8.314=15.023 kJ/mol。

圖4 不同提取條件下(C∞－C)/C∞與時(shí)間的關(guān)系Fig.4 The relationship between relative extraction rate and time under different extraction conditions

表3 不同溫度下多糖相對(duì)萃余率對(duì)時(shí)間的回歸結(jié)果Table 3 Regression results of polysaccharide relative raffinate ratio and time at different temperatures

2.1.4 半衰期 由t1/2對(duì)溫度T作圖，見圖6。通過此公式可計(jì)算出提取一半皂角米多糖所需的時(shí)間。由圖6可知，半衰期和溫度曲線擬合較好(R2=0.9868)。半衰期反映了提取的效率，其數(shù)值與提取速率成反比，數(shù)值越小，提取速率越快。在一定溫度范圍內(nèi)，半衰期與溫度成反比。即提取溫度升高，半衰期減小，升高溫度有利于皂角米多糖提取。

表4 不同料液比下多糖相對(duì)萃余率對(duì)時(shí)間的回歸結(jié)果Table 4 Regression results of polysaccharide relative raffinate ratio with time under different material－liquid ratios

圖5 皂角米多糖lnk與1/T關(guān)系圖Fig.5 Relationship between lnk and 1/T of polysaccharide from seeds of Gleditsia sinensis

圖6 皂角米多糖t1/2與溫度關(guān)系圖Fig.6 Relationship between t1/2 and temperature of polysaccharide from seeds of Gleditsia sinensis

2.2 紅外光譜分析

3422 cm－1出現(xiàn)的是O－H振動(dòng)峰，峰形飽滿，有分子內(nèi)或分子間氫鍵存在［30］;2923 cm－1是C－H伸縮振動(dòng)引起，是多糖的特征吸收峰［31］。1638 cm－1為糖環(huán)上C=O不對(duì)稱收縮引起的振動(dòng)峰，1384 cm－1為C－H彎曲振動(dòng)峰;1010～1100 cm－1附近出現(xiàn)三個(gè)吸收峰(1151、1078、1027)為C－O伸縮振動(dòng)峰，是吡喃糖苷的特征吸收峰，表明皂角米多糖中含有吡喃糖環(huán)［32］;871 cm－1為次甲基振動(dòng)，表明含有β－型糖苷鍵［33］。808 cm－1處為甘露糖的特征吸收峰，524 cm－1處為羰基振動(dòng)變形［34］。

2.3 皂角米多糖抗氧化活性研究

圖7 皂角米多糖紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectrum of polysaccharide from seeds of Gleditsia sinensis

2.3.1 皂角米多糖對(duì)ABTS陽離子自由基的清除能力 從圖8可知，在濃度范圍內(nèi)，皂角米多糖對(duì)ABTS陽離子自由基的清除能力隨濃度的升高而增大。荷葉離褶傘多糖也具有同樣的清除作用，但清除能力不及皂角米多糖［35］。當(dāng)濃度小于0.75 mg/mL，皂角米多糖和VC對(duì)ABTS陽離子自由基的清除能力相差不大;但當(dāng)濃度大于0.75 mg/mL時(shí)，VC的清除能力明顯高于皂角米多糖，并且皂角米多糖的清除能力隨著濃度升高趨于變緩。當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，皂角米多糖對(duì)ABTS陽離子自由基的清除率達(dá)71.82%，IC50為0.072 mg/mL。

圖8 皂角米多糖對(duì)ABTS陽離子自由基的清除率Fig.8 ABTSfree radical scavenging rate of polysaccharides from seeds of Gleditsia sinensis

2.3.2 皂角米多糖對(duì)羥基自由基的清除能力 從圖9可知，當(dāng)濃度小于1 mg/mL時(shí)，皂角米多糖和VC對(duì)羥基自由基的清除率隨濃度的升高快速增加;吳金松等［36］研究鐵觀音茶末多糖抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中也表明了羥基自由基清除能力與多糖質(zhì)量濃度有關(guān)。當(dāng)濃度大于1 mg/mL時(shí)，皂角米多糖和VC對(duì)羥基自由基的清除率趨于穩(wěn)定。在濃度范圍內(nèi)，VC對(duì)羥基自由基的清除率均大于皂角米多糖。當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，皂角米多糖對(duì)羥基自由基清除率達(dá)83.36%，IC50為0.659 mg/mL。

2.3.3 皂角米多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力 從圖10可知，皂角米多糖和VC對(duì)DPPH自由基的清除能力隨濃度的升高而增強(qiáng)，與余騰飛等［37］在研究憂遁草多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的結(jié)論一致。在濃度范圍內(nèi)，VC對(duì)DPPH自由基的清除能力均大于皂角米多糖，但兩者的清除率相差不大。當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，皂角米多糖對(duì)DPPH自由基的清除率為84.00%，IC50為0.722 mg/mL。

圖9 皂角米多糖對(duì)羥基自由基的清除率Fig.9 Scavenging rate of hydroxyl radicals by polysaccharides from seeds of Gleditsia sinensis

圖10 皂角米多糖對(duì)DPPH自由基清除率Fig.10 DPPH free radical scavenging rate of polysaccharides from seeds of Gleditsia sinensis

2.3.4 皂角米多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力 從圖11可知，在濃度范圍內(nèi)，隨皂角米多糖濃度的升高，對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力上升比較平緩，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。當(dāng)濃度小于1 mg/mL，VC對(duì)超氧陰離子自由基清除率隨濃度升高而顯著增強(qiáng)，與陸海勤等［37］研究黃花菜多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的結(jié)論一致。當(dāng)濃度大于1 mg/mL時(shí)，清除率趨于穩(wěn)定。當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，皂角米多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)86.11%，IC50為1.052 mg/mL。

圖11 皂角米多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率Fig.11 Scavenging rate of polysaccharides from seeds of Gleditsia sinensis to superoxide anion free radicals

3 結(jié)論

以Fick第一定律為基礎(chǔ)，以皂角米為研究對(duì)象，用熱水浸提的方式建立了皂角米多糖提取動(dòng)力學(xué)模型，通過該模型可求得不同提取溫度及不同料液比條件下的相關(guān)參數(shù):表觀速率常數(shù)k、相對(duì)萃余率(C∞－C)/C∞、半衰期t1/2、活化能Ea等。該模型計(jì)算值與實(shí)際測(cè)得數(shù)據(jù)吻合良好，計(jì)算結(jié)果表明，ln［C∞/(C∞－C)］與t線性關(guān)系較好，關(guān)系系數(shù)均大于0.9;活化能Ea為15.023 kJ/mol，在一定溫度范圍內(nèi)，升高溫度，有利于皂角米多糖的提取。通過紅外光譜分析，皂角米多糖含有甘露糖，有吡喃糖環(huán)，為β型。皂角米多糖對(duì)ABTS陽離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除率分別為:71.82%、83.36%、84.00%、86.11%，表明皂角米多糖具有一定的抗氧化活性。