王淑婷，唐玉倩，劉增才，鄒莉

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040)

暴馬桑黃(Sanghuangporusbaumii)是寄生在暴馬丁香樹上的一種藥用價(jià)值較高的大型真菌，具有抗菌消炎[1]、降血糖[2]、保護(hù)肝臟[3-4]、抗癌[5]等功效。其良好的藥用效果主要源于其含有的多糖、黃酮、酚類、三萜等活性成分[6-7]。但是這些成分在暴馬桑黃中含量很低[8]，難以滿足生產(chǎn)需求。近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程定向培育優(yōu)質(zhì)的暴馬桑黃菌株成為一種可靠的技術(shù)手段，目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)已在多種真菌中成功實(shí)現(xiàn)，1986年MUNOZ-RIVAS等人在色氨酸營養(yǎng)缺陷型裂褶菌突變株中轉(zhuǎn)入TRPC基因，成功獲得正常菌株[9]；李剛等人在通過PEG轉(zhuǎn)換緩沖液將大腸桿菌潮霉素B轉(zhuǎn)磷酸酶基因轉(zhuǎn)化到靈芝中，成功轉(zhuǎn)化出能穩(wěn)定表達(dá)出HmB抗性的轉(zhuǎn)基因靈芝品種[10]。但目前食藥用菌遺傳轉(zhuǎn)化依舊存在轉(zhuǎn)化表達(dá)效率低的問題[11]，啟動子是控制基因表達(dá)的重要工具，因此找到合適的啟動子是提高食藥用菌轉(zhuǎn)化表達(dá)效率的關(guān)鍵。

食藥用菌遺傳轉(zhuǎn)化所采用的啟動子主要有兩種：一種是ras啟動子，另一種則是gpd啟動子[12]。Hirano等在1999年從香菇中分離出gpd啟動子，將其用于香菇轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建，結(jié)果顯示該體系比ras啟動子轉(zhuǎn)化體系的表達(dá)效率高[13]，這說明gpd啟動子比ras啟動子具有更強(qiáng)的調(diào)控外源基因表達(dá)的能力。此外，gpd啟動子已被用于靈芝[14]、雙孢蘑菇[15]等多種食用菌轉(zhuǎn)化表達(dá)載體的構(gòu)建，表明運(yùn)用gpd啟動子進(jìn)行食用菌轉(zhuǎn)化有很高的可行性。本試驗(yàn)通過對暴馬桑黃中分離出的gpd基因啟動子序列進(jìn)行克隆及序列分析，為建立高效穩(wěn)定的暴馬桑黃外源基因表達(dá)體系奠定基礎(chǔ)，從而獲得優(yōu)質(zhì)的目標(biāo)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株。本研究采用的菌種經(jīng)ITS鑒定為暴馬桑黃(GenBank登錄號為KP974834)，保藏于東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試驗(yàn)試劑。DL Marker 2000、DL Marker 10000、6×Loding Buffer、Premix Taq酶、pMD18-T vector均購自大連Takara公司。Tryptone和Yeast Extract購自O(shè)xoid公司。氨芐青霉素購自納川生物技術(shù)公司?；蚪MDNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自北京天根生化公司。其余藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 暴馬桑黃菌絲培養(yǎng)與收集。將4 ℃保存的暴馬桑黃菌種取出，在超凈工作臺中用滅過菌的接種鉤挑取黃豆粒大小的菌塊接種在PDA培養(yǎng)基中央，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)10 d左右，待菌絲長滿平板后，將表面菌絲體收集到1.5 mL離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2gpd啟動子引物設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)暴馬桑黃基因組數(shù)據(jù)，通過BioEdit軟件篩選得到暴馬桑黃gpd啟動子的電子序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，將其分別命名為gpd-F(5’-AGGTATGACAGTGGAACCAAGCA-3’)和gpd-R(5’-GCATTTCGGAGGACGATACGGC-3’)，在哈爾濱擎科生物公司進(jìn)行引物合成。

1.2.3gpd啟動子序列擴(kuò)增及測序。利用植物基因組DNA提取試劑盒提取暴馬桑黃總DNA，以得到的DNA為模板，gpd-F和gpd-R為引物，對暴馬桑黃gpd啟動子序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂凝膠電泳檢測，純化回收后檢測回收產(chǎn)物濃度。將純化回收的gpd啟動子序列與PMD18-T載體相連接并轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，克隆、篩選和檢驗(yàn)后送至哈爾濱擎科生物公司測序，并將序列提交到GenBank。

1.2.4gpd啟動子序列分析。利用Neural Network Promoter Prediction(http://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)在線網(wǎng)頁對暴馬桑黃gpd啟動子的核心啟動子區(qū)進(jìn)行分析，利用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)以及Gene Promoter Miner(http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)對暴馬桑黃gpd啟動子序列的作用元件、CpG島及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析[16]。

1.2.5gpd啟動子系統(tǒng)發(fā)育分析。將暴馬桑黃gpd啟動子序列測序結(jié)果提交至NCBI進(jìn)行BLAST同源性分析，采用MEGA4軟件構(gòu)建暴馬桑黃與近緣真菌gpd啟動子序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 gpd啟動子的PCR擴(kuò)增結(jié)果及膠回收質(zhì)量檢測

M.Marker 2000；1. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.膠回收產(chǎn)物

以暴馬桑黃總DNA為模板，gpd-F和gpd-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果在大約1400 bp處顯示出特異性條帶；膠回收DNA凝膠電泳檢測得到質(zhì)量較好的單一條帶(圖1)。

2.2 gpd啟動子的連接、轉(zhuǎn)化

將回收的DNA溶液與pMD18-T vector過夜連接，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)13 h后，隨機(jī)挑選6個(gè)單菌落進(jìn)行搖菌擴(kuò)繁，然后進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增檢測。檢測結(jié)果顯示擴(kuò)增出的條帶均呈陽性，大約1500 bp(包含約100 bp的載體序列)，表明目的片段轉(zhuǎn)化成功(圖2)。陽性的克隆產(chǎn)物在哈爾濱擎科生物公司測序后提交至GenBank (登錄號為MT779798)。

M.Marker 10000；1-6.菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 gpd啟動子的序列分析

2.3.1 gpd啟動子核心啟動子區(qū)分析

核心啟動子區(qū)是轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶在啟動子上的結(jié)合區(qū)域，對啟動子的活性有較大影響[17]。利用Neural Network Promoter Prediction對暴馬桑黃gpd啟動子的核心啟動子區(qū)進(jìn)行分析，結(jié)果預(yù)測到3個(gè)核心啟動子區(qū)(表1)，其中在995-1045 bp之間為核心啟動子區(qū)的概率最高，為0.99，其余兩處均低于0.90。

表1 暴馬桑黃gpd啟動子核心啟動子區(qū)預(yù)測

2.3.2gpd啟動子序列作用元件分析。利用plantcare對gpd啟動子作用元件分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)暴馬桑黃gpd啟動子除了含有CAAT-box、TATA-box等典型的啟動子順式作用元件之外，還含有CCAAT-box、G-box、A-box、LTR、ABRE、STRE、MYB等多種重要的作用元件，部分重要元件在gpd序列中的位置及有關(guān)功能見表2及圖3，多種暴馬桑黃gpd啟動子作用元件的存在表明克隆得到的目的基因序列具有調(diào)控基因表達(dá)的功能。

表2 暴馬桑黃gpd啟動子的作用元件種類與功能

2.3.3 CpG島預(yù)測及分析。CPG島常位于真核生物編碼基因的調(diào)控區(qū)，其中啟動子區(qū)中處于非甲基化狀態(tài)的CpG島是基因轉(zhuǎn)錄所必需的；轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是啟動子上與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合的DNA片段，是一些起始轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵結(jié)合部位。通過Gene Promoter Miner對暴馬桑黃gpd啟動子序列的CpG島及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示序列在7-1380 bp之間有一個(gè)CpG島(圖3)，并且發(fā)現(xiàn)啟動子序列中還具有AP1、MAF、OCT1、STAT6、SREBP、IPF1、OSF2等多種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。

暗色部分代表CpG島

2.3.4 暴馬桑黃與其它真菌gpd啟動子序列系統(tǒng)發(fā)育分析。在NCBI網(wǎng)站上對暴馬桑黃gpd啟動子序列進(jìn)行BLAST比對，獲得近緣真菌gpd序列，采用MEGA4軟件構(gòu)建暴馬桑黃與其近源真菌gpd啟動子序列系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。發(fā)現(xiàn)暴馬桑黃gpd啟動子與香菇(GQ457137.1)及糙皮側(cè)耳(HQ286597.1)的gpd啟動子序列同源性相對高，與韋伯靈芝(MN010574.1)和云芝(AY081189.1)等之間的相似性較低，表明gpd啟動子序列在食用真菌種類范圍內(nèi)保守性不強(qiáng)，也可能因?yàn)樵诒R桑黃中還存在其他gpd啟動子[18]。

圖4 暴馬桑黃與其它真菌gpd啟動子的系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討論

gpd啟動子具有的強(qiáng)大調(diào)控外源基因表達(dá)的能力，使其成為食用菌遺傳轉(zhuǎn)化體系中重要的調(diào)控工具。本研究從暴馬桑黃中克隆得到一段1380 bp的gpd啟動子序列，通過分析發(fā)現(xiàn)gpd啟動子在995-1045 bp之間是核心啟動子區(qū)概率最高(0.99)，說明該部位最有可能是轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶結(jié)合的區(qū)域，該結(jié)果有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。其含有典型的啟動子順式作用元件CAAT-box、TATA-box等，以及其他重要作用元件如CCAAT-box、G-box、A-box。TATA-box是決定基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵作用元件，RNA聚合酶與TATA框牢固結(jié)合后才能開始轉(zhuǎn)錄。在該序列中，共有8個(gè)TATA-box，其中4個(gè)在正鏈上，這些TATA-box集中分布在gpd基因啟動子的后半段。CAAT-box是啟動子行使正常功能的重要元件，控制轉(zhuǎn)錄的起始頻率，在暴馬桑黃gpd啟動子中共發(fā)現(xiàn)13個(gè)CAAT-box，且CAAT-box在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)前37-109 bp的區(qū)域內(nèi)分布較集中，與前人研究一致[19]，同時(shí)也可推測本研究克隆的gpd啟動子具有正常的轉(zhuǎn)錄功能。除此之外，在該啟動子中還發(fā)現(xiàn)了參與光反應(yīng)的G-box、參與低溫響應(yīng)的LTR、參與脫落酸反應(yīng)的ABRE等重要順式元件。

此外，經(jīng)過預(yù)測發(fā)現(xiàn)，克隆得到的暴馬桑黃gpd啟動子序列具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，說明克隆得到的啟動子參與多種基因表達(dá)的調(diào)控。根據(jù)是否含有CpG島可將啟動子分為CpG啟動子和非CpG啟動子，啟動子中的CpG島在轉(zhuǎn)錄過程中有重要作用[20]，經(jīng)預(yù)測暴馬桑黃gpd啟動子序列在7-1380 bp之間存在一個(gè)CpG島。但是根據(jù)已有研究，目前發(fā)現(xiàn)的CpG島長度一般在500-1000 bp，此研究預(yù)測得到的CpG島卻長達(dá)1373 bp，出現(xiàn)該結(jié)果的原因尚待進(jìn)一步研究。

以上序列的分析結(jié)果可以初步斷定暴馬桑黃gpd啟動子序列具有啟動子功能，能起到起始轉(zhuǎn)錄的作用。本研究結(jié)果能夠應(yīng)用于建立高效、穩(wěn)定的暴馬桑黃遺傳轉(zhuǎn)化體系，為利用基因工程培育更多目標(biāo)菌株奠定基礎(chǔ)。