王雅芝，張建永，段燦燦

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563000）

肝臟是人體內(nèi)最大的腺體，在人的代謝、膽汁生成、解毒、免疫等過(guò)程中均起著非常重要的作用，是人體內(nèi)的一個(gè)巨大“化工廠”。隨著我國(guó)人民飲食結(jié)構(gòu)和生活環(huán)境的改變，飲酒逐漸增多，酒精性肝?。ˋlcoholic liver disease，ALD）等肝病的患病率正在迅速增加[1]。目前，西藥在治療ALD 等肝病具有一定作用，但仍存在一定的毒副反應(yīng)[2]，中藥方劑在治療肝病上有悠久的歷史，具有多成分、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)綜合作用的特點(diǎn)，且安全性較高。因此，從復(fù)方中藥，特別是藥食兩用中藥中挖掘治療ALD 等肝病的藥物稱為當(dāng)下的熱點(diǎn)。

益肝草涼茶是貴州省貴定縣非物質(zhì)文化遺產(chǎn)飲品，其主要成分由梔子、甘草、枸杞子、大棗、葛根、苦丁茶、魚腥草、覆盆子、蒲公英組成，具有解酒保肝的作用，尤其可以明顯緩解酒后常見(jiàn)的胃腸不適、口干、惡心、頭痛等癥狀。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)益肝草涼茶能夠提高小鼠乙醇脫氫酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶的活性，清除自由基、降低小鼠血清中乙醇、乙醛的含量，達(dá)到解酒保肝的效果[3]。然而益肝草涼茶中化學(xué)成分復(fù)雜，其解酒保肝的有效成分及相應(yīng)的作用機(jī)制尚不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（Network pharmacology）是以系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，其可通過(guò)藥物改善或恢復(fù)生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度來(lái)認(rèn)識(shí)藥物與機(jī)體間的作用關(guān)系。現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究策略與復(fù)方中藥從整體和系統(tǒng)方面治療疾病的的特點(diǎn)具有相通性，為傳統(tǒng)復(fù)方，如半夏瀉心湯、清熱利膽湯等中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究提供了新的手段[4-7]。因此本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、網(wǎng)絡(luò)分析及分子對(duì)接深入揭示了益肝草涼茶解酒保肝作用的藥理機(jī)制，如圖1 所示。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）；中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID）；中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM）；PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)；SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)；TargetNet 數(shù)據(jù)庫(kù)；UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)；比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(CTD)；功能關(guān)聯(lián)蛋白網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（STRING）；生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（DAVID）；RCSBPDB 數(shù)據(jù)庫(kù)；Cytoscape 3.7.1 軟件；AutoDock 軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 化學(xué)成分收集與篩選 本研究運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php），以甘草、枸杞子、大棗、梔子、苦丁茶、魚腥草、覆盆子、葛根為關(guān)鍵詞，檢索8 味中藥的全部化學(xué)成分；運(yùn)用中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/）、中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]查找蒲公英中的化學(xué)成分。以化合物口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 作為活性成分的篩選條件，篩選出9 味中藥的活性成分。

1.2.2 靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與構(gòu)建 通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)未收錄的成分，運(yùn)用ChemDraw 軟件進(jìn)行畫圖，將所有活性成分保存為SDF 格式文件，并上傳SwissTarget Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取每個(gè)成分對(duì)應(yīng)的SMILES 號(hào)，然后上傳TargetNet（http://targetnet.scbdd.com/calcnet/index/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，以AUC≥0.7、預(yù)測(cè)概率（Prob）＞0.9 作為篩選條件，預(yù)測(cè)得到益肝草活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)。采用Cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步采用Networkanalysis 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)特征指標(biāo)度（degree）和介數(shù)（Betweenness）進(jìn)行分析，篩選出益肝草涼茶的關(guān)鍵活性成分。

1.2.3 疾病靶點(diǎn)的篩選與構(gòu)建 通過(guò)UniProt（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“Homo sapiens”，校正靶點(diǎn)為標(biāo)準(zhǔn)基因名，得到益肝草涼茶作用于人源的有效靶點(diǎn)。將有效靶點(diǎn)導(dǎo)入CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//ctdbase.org/tools/batchQuery.go）中進(jìn)行相關(guān)疾病的深入分析，篩選出與肝病相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

1.2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 基于STRING 平臺(tái)將所獲取的疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取蛋白間的相互作用關(guān)系，將結(jié)果保存成TSV 格式并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件繪制相互作用網(wǎng)路，刪除重復(fù)和孤立邊，以節(jié)點(diǎn)（node）大小和顏色設(shè)置用于反映網(wǎng)絡(luò)連接度（degree）的大小，邊（edge）的粗細(xì)設(shè)置用于反映結(jié)合分?jǐn)?shù)的大小，獲得益肝草涼茶作用靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.5 靶點(diǎn)蛋白的基因功能與通路分析 為進(jìn)一步分析靶點(diǎn)蛋白的基因功能及其參與的主要信號(hào)通路，利用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)中的作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因功能及信號(hào)通路富集分析，Select Identifier 設(shè)置為OFFICIALGENESYMBOL，List Type 設(shè)置為Gene List，限定物種為Homo Sapiens，獲取作用靶點(diǎn)參與的主要信號(hào)通路，并使用ImageGP 在線平臺(tái)對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化分析，從而進(jìn)一步了解益肝草涼茶的保肝作用機(jī)制。

1.2.6 整合核心網(wǎng)絡(luò)分析 將上述的活性成分、作用靶點(diǎn)和靶點(diǎn)所富集的主要信號(hào)通路等信息整合到Excel 表格中，分別導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件中，運(yùn)用Merge 功能，將其合并得到中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)-主要通路的分析網(wǎng)絡(luò)，從而進(jìn)一步探討益肝草涼茶解酒保肝作用的整體藥理機(jī)制。

1.2.7 分子對(duì)接 采用AutoDock 軟件對(duì)“中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)-主要通路”網(wǎng)絡(luò)中度值前4 的靶點(diǎn)蛋白與關(guān)鍵成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，并用已上市的抗炎保肝藥物[10]熊去氧膽酸膠囊（Ursodeoxycholic Acid Capules）、雙環(huán)醇片(Bicyclol Tablets)進(jìn)行對(duì)照分析。首先通過(guò)RCSBPDB（http://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取靶點(diǎn)蛋白晶體結(jié)構(gòu)，篩選條件如下：a.通過(guò)X-晶體衍射獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；b.蛋白質(zhì)的晶體分辨率小于3.5 μ；c.優(yōu)先選擇文獻(xiàn)中報(bào)道與靶點(diǎn)蛋白相關(guān)的結(jié)構(gòu)；d.該生物體為Homo sapiens。再利用AutoDock 對(duì)接軟件將篩選出來(lái)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)去水加氫、對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，分別保存為PDBQT 文件；運(yùn)用OpenBabel 軟件將關(guān)鍵成分及熊去氧膽酸膠囊、雙環(huán)醇片的化學(xué)結(jié)構(gòu)SDF 格式轉(zhuǎn)化為PDB 格式。使用其插件AutoGrid 得到對(duì)接活性位點(diǎn)并計(jì)算格點(diǎn)能量，最后運(yùn)用Pymol 軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

本研究共收集到益肝草涼茶中化合物共1043 個(gè)。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 為篩選條件，化合物分子中有214 個(gè)符合條件，其中包括來(lái)自甘草93 個(gè)，來(lái)自枸杞子45 個(gè)，來(lái)自大棗15 個(gè)，來(lái)自梔子15 個(gè)，來(lái)自苦丁茶9 個(gè)，來(lái)自魚腥草7 個(gè)，來(lái)自覆盆子7 個(gè)，來(lái)自蒲公英5 個(gè)，來(lái)自葛根4 個(gè)。經(jīng)去除重復(fù)值得到186 個(gè)化合物，以C1-C186 命名，將其作為活性化合物。運(yùn)用TargetNet 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，選取得分在0.9 以上的靶點(diǎn)，共得到298 個(gè)靶基因。利用Cytoscape3.7.1 軟件，將益肝草涼茶的9 味中藥、186 個(gè)活性成分和298 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)建立可視網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D，如圖2 所示。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出甘草和枸杞子中的活性成分較多，可能是益甘草涼茶中關(guān)鍵藥味。度（degree）是網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中心性指標(biāo)，節(jié)點(diǎn)度值越大表明節(jié)點(diǎn)的中心性越高。運(yùn)用Network analysis 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)特征指標(biāo)進(jìn)行分析，根據(jù)degree 值將排名前30 的活性化合物進(jìn)行分析，如表1所示。其中degree 排名前10 的活性成分鞣花酸、沒(méi)食子酸、槲皮素、油酸乙酯、二十碳五烯酸、香豆素、番紅花酸、山柰酚、5-羥基-7-甲氧基-2-（3,4,5-三甲氧基苯基）色原酮和熊竹素作為益肝草涼茶中可能發(fā)揮作用的關(guān)鍵成分。根據(jù)degree 值對(duì)靶點(diǎn)的大小進(jìn)行設(shè)置，靶點(diǎn)越大表明degree 值越大，其中degree 排名前10 的靶點(diǎn)主要是前列腺素G/H 合酶1（PTGS1）、多酚氧化酶2（PPO2）、花生四烯酸15 脂氧合酶（ALOX15）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（NOS2）、碳酸酐酶6（CA6）、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）、Toll 樣受體9（TLR9）、雌激素受體α（ESR1）、雌激素受體β（ESR2）和芳香化酶（CYP19A1）。上述靶點(diǎn)具有較多的作用配體，且Betweenness Centrality 相對(duì)較高，進(jìn)一步說(shuō)明這些靶點(diǎn)在益肝草涼茶保肝解酒網(wǎng)絡(luò)環(huán)節(jié)中的重要性。

表1 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中度值排名前30 的化合物信息Table 1 Information of the top 30 compounds in the traditional Chinese medicine-active ingredient-target network

圖2 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of traditional Chinese medicine-active ingredient-target

2.2 靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

通過(guò)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)，校正靶點(diǎn)為標(biāo)準(zhǔn)基因名，得到益肝草涼茶中作用于人源的有效靶點(diǎn)有238 個(gè)。將篩選出來(lái)的有效靶點(diǎn)運(yùn)用CTD 進(jìn)行疾病相關(guān)分析，篩選條件P-Vaule≤0.01，篩選出與肝病相關(guān)的疾病有15 種，涉及78 個(gè)疾病靶點(diǎn)，如表2 所示。然后將上述靶點(diǎn)和益肝草涼茶中所含的每味中藥進(jìn)行歸屬，獲得每味中藥對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息，采用TBtools 軟件繪制Upset Plot[11-12]，如圖3 所示。從圖中左側(cè)的條形圖可以看出甘草的疾病靶點(diǎn)個(gè)數(shù)最高（Set size=65），再次證實(shí)甘草可能是益肝草涼茶中的關(guān)鍵藥味。通過(guò)分析右側(cè)點(diǎn)陣部分和上部分條形圖發(fā)現(xiàn)，益肝草涼茶中9 味中藥共有的疾病靶點(diǎn)有23 個(gè)，甘草特有的疾病靶點(diǎn)有6 個(gè)，苦丁茶和覆盆子特有的疾病靶點(diǎn)各1 個(gè)，并且各味中藥之間均具不同數(shù)量的共同靶點(diǎn)，表明藥味之間存在相互協(xié)同。

圖3 疾病靶點(diǎn)在益肝草涼茶中9 味中藥的分布圖Fig.3 Distribution map of 9 traditional Chinese medicines in Yigancao herbal tea

表2 有效靶點(diǎn)作用于肝病的信息Table 2 Information of effective targets acting on liver disease

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將上述78 個(gè)疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)，限定來(lái)源為Homo sapiens，選擇high confidence(0.9)，獲取靶點(diǎn)之間相互作用關(guān)系，保存其TSV 格式文件并導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)分析，共涉及48 個(gè)節(jié)點(diǎn)，84 條邊，如圖4 所示。其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，每條邊表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系。以節(jié)點(diǎn)顏色深淺表示度值的大小，顏色越深代表該節(jié)點(diǎn)度值越大，表明該節(jié)點(diǎn)越關(guān)鍵。其中度值最高的兩個(gè)靶點(diǎn)分別是淀粉樣β 前體蛋白（APP，degree=11）和α-2B 腎上腺素能受體（ADRA2B，degree=8），說(shuō)明這兩個(gè)靶點(diǎn)是益肝草涼茶保護(hù)肝臟的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖4 靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Target protein PPI network

2.4 GO 生物進(jìn)程分析和KEGG 通路富集分析

利用DAVID 在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)益肝草涼茶的PPI網(wǎng)絡(luò)中涉及的48 個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，以GeneRatio、P 值以及調(diào)控通路上的基因個(gè)數(shù)來(lái)衡量GO 和KEGG 富集程度，其中GeneRatio 代表基因的富集程度，P 值代表基因富集在每個(gè)條目的顯著性差異。結(jié)果顯示生物過(guò)程（BP）共得到175 個(gè)Go-terms，主要涉及氧化還原過(guò)程、血壓負(fù)調(diào)節(jié)、磷脂酶C 活性的正調(diào)控、外源性藥物分解代謝過(guò)程、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、胞漿鈣離子濃度的正調(diào)節(jié)等相關(guān)生物進(jìn)程；分子功能（MF）共捕獲59 個(gè)Go-terms，主要涉及與酶結(jié)合、血紅素結(jié)合、氧化還原酶活性、鐵離子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合等方面；細(xì)胞成分（CC）共富集得到24 個(gè)Go-terms，主要涉及質(zhì)膜、質(zhì)膜的組成部分、胞漿、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器等方面。分別將BP、MF 和CC 根據(jù)P≤0.01 進(jìn)行排序，各篩選出前10 個(gè)Go-terms 繪制氣泡圖，如圖5A、5B、5C 所示。KEGG 分析共得到51 條信號(hào)通路，以P≤0.01 進(jìn)行篩選，得到22 條富集程度較高的信號(hào)通路。包括癌癥的途徑（Pathways in cancer）、鈣信號(hào)通路（Calcium signaling pathway）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（Neuroactive ligandreceptor interaction）、5-羥色胺能突觸（Serotonergic synapse）、cGMP-PKG 信號(hào)通路（cGMP-PKG signaling pathway）、鞘脂信號(hào)通路（Sphingolipid signaling pathway）等，如圖5D 所示。

圖5 活性成分相關(guān)靶點(diǎn)功能及通路注釋分析Fig.5 Analysis of target function and pathway annotation of active components

2.5 成分-靶點(diǎn)-通路整合網(wǎng)絡(luò)分析

將益肝草涼茶的活性成分、作用靶點(diǎn)和靶點(diǎn)所富集的主要信號(hào)通路等信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件中，整合構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，直觀地呈現(xiàn)出9 味藥材、186 個(gè)活性成分、48 個(gè)作用靶點(diǎn)及8 條主要信號(hào)通路之間的關(guān)系，具體見(jiàn)如圖6所示。該網(wǎng)絡(luò)由247 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1630 條邊組成，從中可以看出甘草中的活性成分最多（degree=92），枸杞子次之（degree=45），可能是益肝草涼茶中的關(guān)鍵藥味。進(jìn)一步通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析得知：有73 個(gè)活性成分可作用于10 個(gè)以上的靶點(diǎn)（degree≥10），說(shuō)明它們?cè)谝娓尾輿霾杞饩票８委熜е芯哂兄匾饔?；在靶點(diǎn)中，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（NOS2）、前列腺素G/H 合酶1（PTGS1）、雌激素受體α（ESR1）、芳香酶（CYP19A1）的度值最高，分別是115、109、103、102；在信號(hào)通路中，Pathways in cancer、Calcium signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、Serotonergic synapse 這 4 條通路 的degree 排名靠前，可能是益肝草涼茶發(fā)揮解酒保肝作用的重要通路。所以說(shuō)，益肝草涼茶的活性成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，同時(shí)參與到多條信號(hào)通路中，構(gòu)成了一個(gè)具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的整合網(wǎng)絡(luò)。

圖6 中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)-主要通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Network diagram of traditional Chinese medicine-active ingredient-action target-main pathway

2.6 關(guān)鍵成分與4 種靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述得到的關(guān)鍵成分和重要靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，運(yùn)用AutoDock 軟件將“中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)-主要通路”網(wǎng)絡(luò)中度值前4 的NOS2、PTGS1、ESR1、CYP19A1 分別與“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中篩選出來(lái)的10 個(gè)關(guān)鍵成分進(jìn)行分子對(duì)接，選取熊去氧膽酸膠囊、雙環(huán)醇片作為對(duì)照藥，以自由結(jié)合能（binding energy）作為篩選條件，結(jié)合能越小表示對(duì)接結(jié)果越好，比較關(guān)鍵成分與對(duì)照藥自由結(jié)合能的高低，判斷其療效。對(duì)于多構(gòu)象的對(duì)接結(jié)果，篩選出結(jié)合能最低的對(duì)接構(gòu)象，如表3 所示。通過(guò)表3分析得知，在PTGS1、ESR1、CYP19A1 中與關(guān)鍵成分的對(duì)接結(jié)果均強(qiáng)于兩種陽(yáng)性對(duì)照藥，其中關(guān)鍵成分香豆素、番紅花酸的對(duì)接結(jié)果最好。運(yùn)用Pymol 軟件，根據(jù)結(jié)合能的大小選出每個(gè)靶點(diǎn)蛋白對(duì)接最好的前2 位化合物進(jìn)行可視化分析，結(jié)果如圖7 所示。其中香豆素與NOS2、PTGS1、CYP19A1 均可以形成氫鍵，氫鍵鍵長(zhǎng)分別是1.9、2.1/3.4、2.3/2.2/2.3，與靶點(diǎn)ESR1 未形成氫鍵；CYP19A1 與鞣花酸對(duì)接可以形成三個(gè)氨基酸殘基，分別是SER-90、GLY-117、LYS-376，并且其結(jié)合能力高于對(duì)照藥，表明它們是潛在的作用靶點(diǎn)。因此，根據(jù)分子對(duì)接技術(shù)對(duì)益肝草涼茶的關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合能力分析，表明益肝草涼茶對(duì)肝臟具有保護(hù)作用，而且為其進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

圖7 NOS2、PTGS1、ESR1、CYP19A1 與結(jié)合能排序最低的前2 位化合物的最佳對(duì)接構(gòu)象Fig.7 The best docking conformation of NOS2,PTGS1,ESR1,CYP19A1 and the first two compounds with the lowest binding energy

表3 關(guān)鍵成分及對(duì)照藥與NOS2、PTGS1、ESR1、CYP19A1 的結(jié)合能Table 3 Binding energy of key components and control drugs with NOS2,PTGS1,ESR1 and CYP19A1

3 討論

天然藥物作為我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)藥，歷史悠久、資源豐富。中醫(yī)古籍以及中醫(yī)藥現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)許多單味藥材和復(fù)方具有肝臟保護(hù)作用，如清熱解毒利濕類的茵梔黃注射液、復(fù)方夏枯草、龍膽瀉肝湯等；疏肝理氣類的柴胡疏肝散、芍藥甘草湯、逍遙散等；補(bǔ)腎健脾益氣養(yǎng)血類的復(fù)方五仁醇膠囊、養(yǎng)陰軟肝顆粒等；活血化瘀類的血府逐瘀湯、活絡(luò)舒肝膠囊、赤芍、丹參、地龍等[13]?，F(xiàn)代藥理研究表明很多天然藥物也能有效治療或改善肝損傷疾病，如枸杞多糖[14]；蒲公英甾醇[15]；熊果酸[16]。益肝草涼茶共由9 味中藥組成，具有清熱解毒，補(bǔ)脾益氣，護(hù)肝利膽，利尿，緩瀉，退黃疸等功效，已在市場(chǎng)銷售和使用。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其單味藥材的研究甚多，但9 味藥材聯(lián)合發(fā)揮作用的活性成分及作用機(jī)制尚不清楚，為了使益肝草涼茶能夠合理應(yīng)用及推廣，讓更多的消費(fèi)者從中受益，對(duì)其深入研究具有重要意義。

本研究共發(fā)現(xiàn)了益肝草涼茶186 種活性成分，篩選出10 種可能發(fā)揮作用的關(guān)鍵活性成分，包括鞣花酸、沒(méi)食子酸、槲皮素、油酸乙酯、二十碳五烯酸、香豆素等。鞣花酸具有明顯的抗炎作用和抑制氧化應(yīng)激的作用，可以用于治療丙烯酰胺（ACR）引起的肝毒性，還可以通過(guò)降低了肝組織中NF-κB，TNF-α，IL-6 和COX-2 的表達(dá)對(duì)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）基因起到治療作用[17-18]。同時(shí)鞣花酸和槲皮素可改善肝組織氧化還原狀態(tài)，抑制肝臟纖維化相關(guān)基因的表達(dá)水平[19]；沒(méi)食子酸能夠有效地恢復(fù)細(xì)胞活力，減少乙醇刺激肝細(xì)胞釋放天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶，尤其沒(méi)食子酸還可以限制乙醇刺激下的肝細(xì)胞壞死，減少不同壞死信號(hào)受體相互作用蛋白1（RIP1）和RIP3 的表達(dá)，高遷移率族盒蛋白1 的釋放[20]。槲皮素可以通過(guò)下調(diào)RNA 依賴性蛋白激酶樣ER 激酶（PERK）起到保護(hù)肝細(xì)胞免受乙醇中毒的作用，降低飲酒后ALT、AST 的升高[21]。香豆素可通過(guò)激活Nrf2 信號(hào)通路從而保護(hù)ALD，并降低酒精性脂肪肝向肝癌的轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)[22]，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述成分是益肝草涼茶發(fā)揮作用的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。為了確證益肝草涼茶解酒保肝作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究采用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)益肝草涼茶的關(guān)鍵成分與“中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)-主要通路”網(wǎng)絡(luò)圖的度值排名前四的靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接驗(yàn)證，以已上市的熊去氧膽酸膠囊、雙環(huán)醇片作為對(duì)照藥。結(jié)果顯示，益肝草涼茶中的關(guān)鍵活性成分香豆素、番紅花酸、鞣花酸等6 種對(duì)接后結(jié)合能優(yōu)于對(duì)照藥，再一次證實(shí)了益肝草涼茶對(duì)肝臟的保護(hù)作用，為治療ALD 提供了科學(xué)依據(jù)。

通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，上述活性成分可通過(guò)作用于前列腺素G/H 合酶1（PTGS1）、多酚氧化酶2（PPO2）、花生四烯酸15 脂氧合酶（ALOX15）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（NOS2）、碳酸酐酶6（CA6）、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）、Toll 樣受體9（TLR9）、雌激素受體α（ESR1）、雌激素受體β（ESR2）和芳香化酶（CYP19A1）等靶點(diǎn)發(fā)揮解酒保肝的作用。Zhang 等[23]發(fā)現(xiàn)ALOX15 基因敲除可通過(guò)減少氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、脂質(zhì)代謝紊亂和細(xì)胞死亡信號(hào)來(lái)預(yù)防ALD。MIF 是一種多功能細(xì)胞因子，參與機(jī)體對(duì)損傷后的炎癥反應(yīng)。研究表明發(fā)現(xiàn)抑制MIF 產(chǎn)生有助于治療過(guò)度飲酒引起的肝損傷[24]。結(jié)合分子對(duì)接驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，PTGS1、NOS2、ESR1 和CYP19A1是潛在的作用靶點(diǎn)。NOS2 合成的NO 可以通過(guò)熱休克蛋白70 家族（HSP70 家族）和血紅素加氧酶1（Hmox1）的誘導(dǎo)提高肝細(xì)胞活力[25]。Khristi 等[26-27]發(fā)現(xiàn)ESR1 是肝臟的主要受體，ESR1 的丟失增加了雌性大鼠的體重增加和肥胖，并且ESR1 基因敲除（ESR1-/-）雄性大鼠的代謝紊亂與ESR1 在肝臟中轉(zhuǎn)錄調(diào)控的喪失有關(guān)。綜上可知，益肝草涼茶正是通過(guò)“多成分-多靶點(diǎn)-協(xié)同作用”，實(shí)現(xiàn)其解酒保肝的功效。

基于STRING 交互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建益肝草涼茶保肝作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示其活性成分靶點(diǎn)蛋白間存在相互關(guān)系，是一個(gè)復(fù)雜交互的網(wǎng)絡(luò)而并非單獨(dú)起作用。GO 分析結(jié)果表明，益肝草涼茶活性成分作用的靶點(diǎn)主要富集在氧化還原過(guò)程、血壓負(fù)調(diào)節(jié)、磷脂酶C 活性的正調(diào)控、外源性藥物分解代謝過(guò)程、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路和胞漿鈣離子濃度的正調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程，涉及蛋白激酶、氧化還原酶、血紅素、質(zhì)膜、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器等多種物質(zhì)的參與，是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。細(xì)胞膜受損是肝細(xì)胞受損的最基本表現(xiàn)，影響細(xì)胞正常生理功能；當(dāng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)斷裂時(shí)，大量的Ca2+內(nèi)流，造成細(xì)胞腫脹，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡[11]。通路富集分析顯示癌癥的途徑、鈣信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、5-羥色胺能突觸以及cGMP-PKG 信號(hào)通路等是益肝草涼茶作用的主要途徑。在癌癥途徑中，共涉及靶點(diǎn)14 個(gè)，劉素彤等人[28]研究發(fā)現(xiàn)肝臟內(nèi)有大量的免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞可以通過(guò)介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）分泌TNFα 促進(jìn)NASH 惡性轉(zhuǎn)化，主要原因是巨噬細(xì)胞的免疫M(jìn)2 表型，M2 極化巨噬細(xì)胞常常存在于腫瘤微環(huán)境中，這與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。在鈣信號(hào)通路中，共涉及11 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，其靶點(diǎn)主要來(lái)自甘草中的活性成分，有文獻(xiàn)報(bào)道鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)可導(dǎo)致ROS 形成增加，線粒體去極化，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡[29-30]；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠或脂肪變性肝細(xì)胞中受損的鈣信號(hào)顯著加重肝臟脂肪變性[31]。中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)是影響肝細(xì)胞色素P450（CYP）功能的重要因素，與重要靶點(diǎn)CYP19A1 密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素能和5-羥色胺能系統(tǒng)也參與了肝臟CYP 的調(diào)節(jié)，同時(shí)多種神經(jīng)遞質(zhì)（乙酰膽堿、腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺）對(duì)肝功能的影響及肝細(xì)胞色素氧化酶活性的生理調(diào)節(jié)也尤為重要[32]。以上研究表明，益肝草涼茶可通過(guò)上述成分、靶點(diǎn)、通路發(fā)揮解酒保肝的作用。

綜上所述，本研究基于多成分、多靶點(diǎn)、多通路的研究思路，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，分析益肝草涼茶保肝作用靶點(diǎn)，構(gòu)建益肝草涼茶保肝作用靶點(diǎn)的交互作用網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，富集保肝作用相關(guān)的生物過(guò)程和通路，闡述并驗(yàn)證益肝草涼茶解酒保肝作用機(jī)制，為益肝草涼茶應(yīng)用于臨床應(yīng)用提供科學(xué)可靠依據(jù)，同時(shí)也為研究其他復(fù)方中藥提供了思路和方法。