鄭余銀，馮藝佳，阮青青，屠文展

1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 康復醫(yī)學科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325015

帕金森病（Parkinson"s disease，PD）是世界上第二大神經(jīng)退行性疾病，其主要臨床表征為靜止性震顫、肌肉僵直、運動遲緩，部分患者伴有焦慮、抑郁、記憶減退等精神類障礙[1]。左旋多巴胺藥物被廣泛應用于PD患者治療中，但該藥物對靜止性震顫無效，且會造成腸胃不適、惡心等不良反應，同時，長期服用左旋多巴胺的PD患者表現(xiàn)出對藥物不敏感，且伴隨易動癥[2-4]。因此，尋找新的用于緩解或治療PD的藥物具有重要的臨床和社會價值。咖啡因是咖啡的主要活性成分之一，大量的流行病學調(diào)查表明長期飲用咖啡可有效延緩PD的病理進程[5-7]。LUAN等[8]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，長期飲用咖啡因可有效減輕小鼠紋狀體由α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-Syn）聚集引起的細胞凋亡及炎癥反應，但咖啡因在PD病理進程中的保護機制尚不明確。本研究通過在小鼠海馬腦區(qū)注射α-Syn纖維體，模擬α-Syn在海馬腦區(qū)累積而引起的認知功能障礙，利用轉(zhuǎn)錄組學分析探討咖啡因緩解α-Syn造成認知功能受損的可能分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：10周齡雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量22～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司上海分公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2017-0011。飼養(yǎng)環(huán)境為（23±2）℃，12 h/12 h光照/暗周期。所有實驗動物操作規(guī)范均按照溫州醫(yī)科大學實驗動物管理規(guī)定進行。

1.1.2 試劑和儀器：α-Syn纖維體（No.SPR-317）購自加拿大StressMarq公司；咖啡因（Cat#C0750）和戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司；DAB試劑盒（abs957）購自上海Absin公司；α-Syn抗體（ab209538）購自英國Abcam公司；RNA提取試劑TRIzolTM（15596026）購自美國Thermo Fisher公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒（RR037A）購自日本Takara公司；SYBR Green試劑購自美國BIO-RAD公司；光學顯微鏡DFC7000 T購自德國Leica公司；腦立體定位儀（68507）購自深圳瑞沃德生命科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 α-Syn誘導的PD動物模型的建立：按照HU等[9]的方法，利用腦立體定位注射技術，將5 μg（溶于3 μL PBS溶液）α-Syn纖維體或同等體積的無菌PBS注射到10周齡雄性小鼠雙側(cè)海馬區(qū)（坐標：AP，-2.2 mm；ML，±1.5 mm；DV，-2.3 mm）。

1.2.2 分組與處理：根據(jù)LUAN等[8]的方法，將咖啡因溶于飲用水中（1 g/L）。實驗分為3組：PBS造模飲水組（PBS組，n=10），α-Syn造模飲水組（α-Syn組，n=9）和α-Syn造?？Х纫蛱幚斫M（α-Syn-Caff組，n=10）。α-Syn造模后，連續(xù)3個月每天給予實驗小鼠咖啡因或水飲用。

1.2.3 α-Syn免疫組織化學染色：用二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）進行α-Syn染色。α-Syn造模3個月后，每組3只小鼠進行深度麻醉（0.3%戊巴比妥鈉）；PBS及PFA灌注后取腦組織進行石蠟包埋并制備切片（30 μm）；腦片經(jīng)2 h烘烤（55～60 ℃）、梯度乙醇水化、抗原修復后，滴加3% H2O2，室溫孵育10 min，PBS洗3次；5%羊血清封閉30 min后，滴加α-Syn抗體，4 ℃過夜；PBS洗3次，用DAB試劑顯色后，進行蘇木素復染、脫水、二甲苯透明及封片，顯微鏡下進行觀察拍攝。

1.2.4 Y迷宮實驗：Y迷宮實驗用于檢測小鼠的工作記憶，將實驗小鼠放置于Y迷宮的A臂，記錄5 min內(nèi)小鼠在Y迷宮中的進臂順序。如：A-B-C，AC-B記為正確順序，A-B-A或A-C-A記為錯誤順序。統(tǒng)計正確率來評估小鼠的工作記憶能力[10]。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組測序分析：Y迷宮實驗后，小鼠麻醉（0.3%戊巴比妥鈉）并用PBS灌注后，于冰板上迅速分離海馬組織，液氮速凍后-80 ℃保存。利用TRIzol法提取總RNA，A260/280=1.9～2.0符合建庫要求，并送至北京諾禾致源技術有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序及后續(xù)生物信息學分析[差異基因篩選標準：log2（fold change）＞1.3]。

1.2.6 熒光定量PCR（qPCR）：對應樣本的RNA（1 μg）經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用SYBR-Green法進行熒光定量，檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄表達水平。各基因qPCR的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用Graphpad 5.0軟件進行分析。計量資料采用±s表示，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 長期飲用咖啡因有效改善α-Syn引起的工作記憶障礙 DAB染色觀察α-Syn的聚集情況。α-Syn蛋白在造模飲水組小鼠海馬腦區(qū)有明顯聚集，呈胞體樣結(jié)構(gòu)，證明造模成功。相較于α-Syn組，α-Syn-Caff組小鼠的α-Syn聚集明顯較少，見圖1A。Y迷宮實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于PBS組小鼠，α-Syn造模后，小鼠在Y迷宮中的進臂順序正確率明顯下降（P＜0.05），表明其工作記憶表現(xiàn)能力受損；而α-Syn-Caff組相較于α-Syn組，其工作記憶能力有顯著改善（P＜0.05），見圖1B。

圖1 咖啡因改善α-Syn誘導的工作記憶障礙

圖2 α-Syn蛋白引起海馬腦區(qū)小膠質(zhì)細胞活化

2.2 α-Syn蛋白促進海馬腦區(qū)小膠質(zhì)細胞的活化 通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)：相對于PBS組，α-Syn組在轉(zhuǎn)錄水平上有431個基因顯著上調(diào)（P＜0.05），232個基因下調(diào)（P＜0.05），見圖2A。經(jīng)KEGG聚類分析后發(fā)現(xiàn)：差異基因主要集中在破骨細胞分化、細胞內(nèi)吞及趨化反應等信號通路，見圖2B。在α-Syn組的轉(zhuǎn)錄表達譜中，Tmemll9和Cx3crl表達水平顯著升高（P＜0.05），隨后用qPCR驗證了這一結(jié)論；此外，Trl9在α-Syn組也呈現(xiàn)高表達（P＜0.05），見圖2C。

2.3 長期飲用咖啡因增強神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的增殖能力 在對α-Syn組和α-Syn-Caff組進行轉(zhuǎn)錄組差異基因分析，發(fā)現(xiàn)有363個基因上調(diào)（P＜0.05），277個基因下調(diào)（P＜0.05），見圖3A。我們對這些差異基因進行KEGG聚類發(fā)現(xiàn)：只有趨化因子信號顯著上調(diào)（P＜0.05），這說明咖啡因可能增強了對病變周圍免疫細胞的招募，對損傷組織進行修復（見圖3B）。但是，咖啡因?qū)Ζ?Syn引起的小膠質(zhì)細胞分化、內(nèi)吞作用及免疫調(diào)節(jié)均無顯著改善。因此，我們對差異基因進行GO注釋分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相對于α-Syn組，α-Syn-Caff組富集的功能注釋主要集中在細胞增殖（包括干細胞、神經(jīng)前體細胞和膠質(zhì)細胞）和調(diào)節(jié)突觸傳遞方面，見圖3C。我們對參與細胞增殖的關鍵基因Sox2和VEGFA進行了qPCR驗證，發(fā)現(xiàn)咖啡因飲用可以顯著誘導Sox2和VEGFA轉(zhuǎn)錄表達（P＜0.05），見圖3D。

3 討論

研究表明α-Syn纖維體被神經(jīng)元吸收，誘導正常的內(nèi)源性α-Syn向其聚集，從而形成包涵體并在大腦中呈現(xiàn)朊病毒樣擴散。異常聚集的α-Syn可通過氧化應激、細胞毒性等方式造成神經(jīng)元的損失[11-12]。LUK等[13]在腦區(qū)注射α-Syn纖維體模擬PD的認知障礙和運動障礙。本研究選擇海馬注射α-Syn纖維體模擬PD的病理特征及認知功能缺陷表型，來探討咖啡因的認知功能保護作用機制。

圖3 長期飲用咖啡因有效增強細胞增殖能力

部分PD患者在運動癥狀之前就表現(xiàn)出明顯的認知功能障礙，這可能與α-Syn在腦內(nèi)的擴散方式有關。當α-Syn擴散并異常聚集在參與認知的腦區(qū)或神經(jīng)元時，伴隨著神經(jīng)元的退行性病變，認知能力會逐漸下降。在模型中，在海馬神經(jīng)元注射α-Syn 3個月后，α-Syn蛋白在該腦區(qū)大量聚集，小鼠表現(xiàn)出明顯的認知缺陷；而飲用咖啡因后α-Syn的聚集大量減少，且有效緩解其造成的工作記憶能力損傷。這一結(jié)論與LUAN等[8]和HU等[9]在紋狀體腦區(qū)注射α-Syn并給予咖啡因處理的結(jié)果相一致，進一步證明了咖啡因?qū)D認知功能的保護作用。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細胞的活化，尤其是促炎M1型的分化是PD病理的主要變化之一。一直以來，關于α-Syn促進小膠質(zhì)細胞活化的分子機制是PD的研究熱點之一。小膠質(zhì)細胞的激活及促炎因子的釋放一直被認為是神經(jīng)退行性病變的共同病理表現(xiàn)。大多數(shù)觀點認為：小膠質(zhì)細胞的活化是由于α-Syn、Aβ或Tau蛋白等異常聚集引起的[14-16]。有研究指出α-Syn可通過與小膠質(zhì)細胞表面的TLR受體相互作用來激活膠質(zhì)細胞[17]。近期的多巴胺神經(jīng)元移植實驗表明，α-Syn引起的小膠質(zhì)細胞活化可能參與了PD病理的發(fā)生發(fā)展，小膠質(zhì)細胞在α-Syn病理性聚集及傳播中發(fā)揮了重要的作用[18]。Tmem119是小膠質(zhì)細胞活化的標志物，在活化的小膠質(zhì)細胞中高表達[19]。本研究發(fā)現(xiàn)咖啡因飲用可有效降低Tmem119的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.05）。這暗示著咖啡因可有效減輕α-Syn引起的小膠質(zhì)細胞活化及炎癥反應。隨著對Tmem119操控技術的發(fā)展[20]，抑制Tmem119可能是潛在的有效緩解PD的治療策略。

ALE-AGHA等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚受到紫外線損傷時，咖啡因會促進細胞的DNA修復；咖啡因還可以促進p27蛋白（細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B）向線粒體的轉(zhuǎn)運，從而增強心臟細胞的抗損傷能力。另有研究發(fā)現(xiàn)，給予小鼠適量的咖啡因，可促使衰老小鼠的心肌功能得到極大改善，同時加快心肌受損后的修復[22]。在轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)，咖啡因的主要功能也是富集在促細胞增殖信號通路。這說明在PD的病理進程中，咖啡因的保護作用可能正是增強了神經(jīng)元及其他類型細胞的修復及增殖能力來對抗α-Syn的損傷作用。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)咖啡因可有效改善海馬腦區(qū)的小膠質(zhì)細胞的炎癥反應，增強細胞的增殖能力，并改善小鼠的認知功能障礙，為闡明咖啡因?qū)D的保護機制提供了新證據(jù)。