吳婉琴，江 豐, ，范小龍，朱曉玲，黃 坤，韓 智，劉國姣，張亞珍，朱松松，范志勇，王會霞

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北武漢 430075；2.湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術研究中心，湖北武漢 430075）

工業(yè)松香是一種化工原料，其主要成分為樹脂酸，包括脫氫松香酸、松香酸和其它與松香酸互為同分異構體的樹脂酸等，還含有鉛等重金屬和有毒、有害物質(zhì)。經(jīng)常用于油漆涂料、肥皂、黏合劑、橡膠、造紙、建筑材料等工業(yè)。因其加熱后黏附性較優(yōu)，曾常被用來進行畜禽類的二次脫毛用以提高脫毛效率。有研究表明松香具有一定的毒性[1?3]，其所含主要樹脂酸松香酸和脫氫松香酸能夠造成人體紅細胞和多核性白細胞壞死[4?5]，屬內(nèi)分泌干擾物[6]和致癌物[7]，具有一定的遺傳毒性[8]。使用工業(yè)松香對畜禽脫毛，其主要成分進入畜禽因受熱而擴張的毛孔內(nèi)，對畜禽肉制品造成污染從而危害人體健康，因此國家于NY 467-2001《畜禽屠宰衛(wèi)生檢疫規(guī)范》[9]和2018版《中華人民共和國食品安全法》第三十四條均明令禁止在畜禽屠宰中使用松香作為脫毛助工劑[10]。

在現(xiàn)有研究中，對于工業(yè)松香的定性鑒別和定量分析多集中于對其主要樹脂酸成分松香酸和脫氫松香酸進行分析，定性鑒別多采用薄層色譜法[11?12]、紅外光譜法[13?14]等，定量分析多采用氣相色譜法[15?16]、高效液相色譜法[17?23]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[24]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[25?30]等。采用氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用色譜法分析時，需對樣品進行衍生化處理，操作繁瑣且重現(xiàn)性較差。采用液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用色譜對松香酸進行檢測時，因?qū)λ上闼岷团c松香酸互為同分異構體的樹脂酸分離效果較差，導致該法所分析的松香酸實際為松香酸、海松酸、異海松酸等松香酸同分異構體樹脂酸之和[31]，不能準確定性定量。學者選擇脫氫松香酸為分析對象時，采用外標法定量，可以避免選擇松香酸作為分析對象時定性的不準確性，但由于畜禽肉樣品中的脂肪干擾物質(zhì)高，導致外標法定量過程中基質(zhì)干擾強，影響定量準確性。

為克服現(xiàn)有研究中選擇松香酸作為研究對象的定性不準確性和外標法分析的定量不準確性，本研究選擇與其余樹脂酸不為同分異構體，且含量較高危害較大的成分-脫氫松香酸作為工業(yè)松香特征指標，通過內(nèi)標法采用同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行測定分析，用以對畜禽表皮中違法使用松香進行識別和確證。該方法較外標定量方法有基質(zhì)干擾小、定量準確度高、靈敏度高的優(yōu)點，在日常檢測方面存在一定的優(yōu)勢。在實際監(jiān)測中，本研究組已發(fā)現(xiàn)在多批次畜禽表皮中有較高含量的工業(yè)松香特征成分脫氫松香酸，工業(yè)松香非法用于食品行業(yè)這一行為危及消費者身體健康，因此建立快速、可靠的方法來分析監(jiān)測工業(yè)松香在食品中的殘留迫在眉睫。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

畜禽肉及其制品樣品（雞、雞翅、雞腿、豬尾、豬耳、鴨、鴨翅、鴨腿） 均購自于居民日常消費的菜場、農(nóng)貿(mào)市場、超市等地，采集的所有樣品取表皮組織，采用粉碎機進行粉碎處理，置于密封袋中，于?20 ℃下冷凍保存，待檢測；松香 河南鴻義源化工有限公司；松香甘油酯 無錫市雙惠化工有限公司；脫氫松香酸（純度≥98%）、脫氫松香酸-6,6-D2（純度≥95%） 日本TRC 公司；乙腈、甲醇 色譜純，德國Merck 公司；甲酸 質(zhì)譜純，美國Fisher Scientific公司；超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm，25 ℃） 美國Millipore 公司；其他試劑 均為分析純。

Ultimate 3000 高效液相色譜儀 美國Thermo公司；AB Sciex Qtrap 6500 型串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀 美國AB Sciex 公司；Allegra X-15R 型離心機 美國Beckman 公司；GM300 型粉碎機 德國氟爾德公司；EDAA-2600T 型超聲儀 上海安譜科學儀器有限公司；945605 渦旋混合器 美國TALBOYS 公司；ME2002E 分析天平 梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司；固相萃取裝置 德國Retsch 公司；C18 固相萃取柱（200 mg/mL） 美國Waters 公司；0.22 μm 有機系濾膜 天津津騰公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 標準儲備液：準確稱取標準品，折算成脫氫松香酸10.0 mg（精確至0.0001 g），置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1 mg/mL 標準儲備液，置于?18 ℃環(huán)境中冷凍避光保存。

標準工作溶液：準確移取1.0 mL 標準儲備液，置于100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為10 μg/mL 的標準中間液，置于4 ℃環(huán)境中冷藏避光保存。

同位素內(nèi)標儲備液：準確稱取內(nèi)標標準品，折算成脫氫松香酸-6,6-D210.0 mg（精確至0.0001 g），置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1 mg/mL 標準儲備液，置于?18 ℃環(huán)境中冷凍避光保存。

同位素內(nèi)標工作溶液：準確移取1.0 mL 內(nèi)標儲備液，置于50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為20 μg/mL 的內(nèi)標中間液，置于4 ℃環(huán)境中冷藏避光保存。

根據(jù)實驗需要采用甲醇逐級稀釋成標準系列工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 提取 稱取約1 g（精確至0.01 g）畜禽肉表皮組織試樣，置于50 mL 離心管中，加入50 μL 20 μg/mL 內(nèi)標溶液和10 mL 乙腈，渦旋1 min 混勻后，于超聲儀超聲30 min，4000 r/min 離心5 min，準確移取上清液5 mL，加入10 mL 水混勻，待凈化。

1.2.2.2 凈化 C18 固相萃取柱先采用3 mL 乙腈、3 mL 水活化，使柱體處于濕潤狀態(tài)。取待凈化液上樣于萃取柱，流速不大于1 mL/min，用3 mL 20%乙腈水溶液淋洗小柱，棄去全部流出液，在65 kPa 的負壓下，抽干2 min，最后用4 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液，加入甲醇定容至5 mL，渦旋0.5 min，經(jīng)0.22 μm有機系濾膜過濾后，取續(xù)濾液（依測定情況稀釋相應倍數(shù)）供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm,1.8 μm）；流動相：乙腈+含0.1%甲酸水溶液=70:30；柱溫：35 ℃；進樣量：3 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正模式掃描；多反應監(jiān)測模式（MRM）；電噴霧電壓：5500 V；離子源溫度：500 ℃；去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）、監(jiān)測離子對和定量離子對等信息見表1。

表1 質(zhì)譜MRM 參數(shù)Table 1 Mass spectrometry Parameters

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用AB Sciex Multi Quant 色譜數(shù)據(jù)處理軟件對樣品中所含目標化合物進行定性定量分析，各平行樣間數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 進行計算，圖采用OriginPro 8 軟件和GraphPad Prism 5 軟件完成。

2 結果與分析

2.1 目標化合物的選擇

松香的主要成分為樹脂酸，主要為松香酸、脫氫松香酸、新松香酸、山達海松酸、海松酸、左旋海松酸、異海松酸、長葉海松酸等，其中，脫氫松香酸分子式為C20H28O2，其余樹脂酸均互為同分異構體，分子式為C20H30O2。

前期試驗采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對以上樹脂酸進行了分析方法的建立，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行測定，需要對樣品進行衍生化處理，操作較繁瑣，且畜禽表皮組織脂肪含量較高，衍生過程中基質(zhì)中所含脂肪酸也一并被衍生化，雜質(zhì)干擾較大，對目標化合物測定影響較大。

考慮選擇干擾較少，準確度高、靈敏度高的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析各樹脂酸，結果顯示，松香酸與左旋海松酸、新松香酸、山達海松酸、異海松酸、海松酸、長葉海松酸在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀上，色譜峰出峰保留時間一致，定性離子與定量離子一致，難以分離，各化合物于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀色譜圖見圖1，若使用其中某一樹脂酸對樣品中樹脂酸進行定量分析，實則該方法所分析的樹脂酸可能為松香酸、山達海松酸、異海松酸等松香酸同分異構體樹脂酸之和，故最終選擇與其余樹脂酸不為同分異構體，且含量較高危害較大的成分（脫氫松香酸）作為特征指標，本方法選用結構與基本性質(zhì)和脫氫松香酸無異，出峰時間接近的脫氫松香酸-6,6-D2作為內(nèi)標物，采用內(nèi)標法進行定量，用以對畜禽表皮中違法使用松香進行識別和確證，此法克服了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和外標法基質(zhì)干擾強、定量準確性不足的缺點。

圖1 8 種樹脂酸高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of the eight resin acid derivatives using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

2.2 目標物特異性的考察

對不同畜禽類表皮組織使用工業(yè)松香和食品松香甘油酯進行脫毛，形成非法使用松香模擬陽性樣品及合法使用松香甘油酯模擬陰性樣品。分別對工業(yè)松香原料、工業(yè)松香模擬脫毛陽性樣品、松香甘油酯原料、松香甘油酯模擬脫毛陰性樣品進行檢測，結果表明，工業(yè)松香原料、工業(yè)松香模擬脫毛陽性樣品均檢測出脫氫松香酸，松香甘油酯原料、松香甘油酯模擬脫毛陰性樣品并未檢測出脫氫松香酸。具體結果見圖2。

圖2 不同樣品中目標物提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of the target substance in the sample

2.3 提取溶劑的選擇

比較考察了甲醇、乙腈、乙醇3 種提取溶劑對畜禽表皮樣品中脫氫松香酸的提取效率。本研究在空白畜禽表皮組織樣品中添加了200 μg/kg 目標物，分別以甲醇、乙腈、乙醇進行提取。以甲醇和乙醇提取時，雜質(zhì)干擾峰影響大，且脫氫松香酸回收率較低，結果如圖3 所示，故乙腈更適合作為提取液。

圖3 不同提取溶劑對脫氫松香酸提取效率的影響Fig.3 Effect of different extraction solvents on the extraction efficiencies of dehydroabietic acid

2.4 凈化條件的優(yōu)化

動物表皮組織所含成分種類多，脂肪含量高，雜質(zhì)干擾大，對檢測儀器產(chǎn)生一定的污染，因此需進一步凈化處理。根據(jù)目標物的結構性質(zhì)，對比了主流固相萃取柱Waters、Agela、Thermo 生產(chǎn)廠家的MAX陰離子交換柱、PEP 柱、PEP-2 柱、HLB 柱和C18柱等固相萃取柱。采用標準溶液直接過固相萃取柱凈化的方式考察其對脫氫松香酸的影響。結果如圖4 所示，脫氫松香酸屬于弱極性化合物，C18固相萃取柱對其有較好的吸附力，回收率較好，最終選擇C18 柱凈化。

圖4 不同固相萃取柱對脫氫松香酸回收率的影響Fig.4 Effect of different solid phase extraction columns on the recoveries of dehydroabietic acid

樣品用乙腈提取后，分別考察上樣液中乙腈溶液與水溶液的比例對回收率的影響，對純乙腈、乙腈:水（v/v=1:0.5）、乙腈:水（v/v=1:1）、乙腈:水（v/v=1:2）、乙腈:水（v/v=1:3）、乙腈:水（v/v=1:4）、乙腈:水（v/v=1:5）、純水上樣液分別進行試驗，各上樣液中脫氫松香酸濃度為40 ng/mL，并將上樣分析液直接過柱流下液體接收并上機測定，實驗表明，當上樣分析液中乙腈比例過高時，使得上樣液極性較弱，目標物不易于被C18 柱吸附保留，因被直接流出而損失，隨著水比例的增加，目標物直接流出柱體含量趨于穩(wěn)定，具體結果見圖5 所示。由于脫氫松香酸脂溶性較好水溶性差，且C18 固相萃取柱保留目標物使用極性較弱溶液洗脫容易，發(fā)現(xiàn)將提取液氮吹干后采用純水復溶作為上樣液會影響脫氫松香酸復溶從而降低回收率，且水比例高時上樣液體積較大影響上樣效率，結合兩組數(shù)據(jù)分析，故最后確定上樣液比例為乙腈:水（1:2），在上樣液體積適中的情況下保證了合適的回收率。具體結果如圖6。

圖5 不同比例上樣液對脫氫松香酸保留的影響Fig.5 Effect of different proportion of sample solution on retention of dehydroabietic acid

圖6 不同比例上樣液對脫氫松香酸回收率的影響Fig.6 Effect of different proportion of sample solution on the recoveries of dehydroabietic acid

樣品溶液于C18 固相萃取柱上樣后，選擇10%、20%、30%、40%、50%、60%乙腈-水溶液作為淋洗液對淋洗效果進行考察，實驗表明，乙腈體積分數(shù)較高時，雜質(zhì)干擾影響小但目標物回收率較低，乙腈體積分數(shù)較低時，雜質(zhì)干擾較多但目標物回收率較好，綜合考慮，20%乙腈-水溶液溶液可以保證脫氫松香酸回收率較優(yōu)且可較好地去除部分雜質(zhì)，因而選擇20%乙腈-水溶液作為淋洗液。結果見圖7。

圖7 不同比例淋洗液對脫氫松香酸回收率的影響Fig.7 Effect of different proportion of eluent on the recoveries of dehydroabietic acid

淋洗液確定后，再進行洗脫液考察，因為目標化合物脫氫松香酸屬極性偏弱化合物，選擇甲醇、乙酸乙酯、正己烷作為洗脫液。結果見圖8。甲醇作為洗脫液的回收率較另外兩種溶劑高，故選擇甲醇作為洗脫液。

圖8 不同洗脫溶劑對脫氫松香酸回收率的影響Fig.8 Effect of different eluent solvents on the recoveries of dehydroabietic acid

2.5 色譜條件的優(yōu)化

前期考察結果顯示，正模式下，加入一定量甲酸于流動相中可增加離子化效率，使峰形得到改善，但加入量偏高時則會減弱離子化效率。本實驗選擇0.1%甲酸溶液為流動相。有機相考察甲醇、乙腈，結果表明選用乙腈時分析物峰形的對稱性更好。因此選擇乙腈?0.1%甲酸溶液為流動相，目標化合物峰形好且靈敏度高。

確定流動相體系后，進一步考察了流動相不同比例對目標物的分離效果影響，通過比較試驗發(fā)現(xiàn)，采用梯度洗脫時，由于脫氫松香酸極性較弱，出峰時間滯后且峰形不佳，樣品中脫氫松香酸色譜峰與雜質(zhì)干擾峰難以分離。故選擇等度洗脫進行分析，并對流動相的不同比例：乙腈?0.1%甲酸溶液（80:20、75:25、70:30、65:35、60:40）進行考察，由圖9 可知，流動相有機相比例較高時，目標物出峰時間較早且可能包含有雜質(zhì)峰影響定量，流動相有機相比例較低時，出峰時間較晚所需分析時間較長，當流動相為乙腈?0.1%甲酸溶液（70:30）時，峰形尖銳對稱性佳，分析時間適中且目標物與雜質(zhì)分離度較優(yōu)，故選擇乙腈?0.1%甲酸溶液（70:30）為流動相。

圖9 不同流動相比例對脫氫松香酸的色譜分離圖Fig.9 Chromatograms of dehydroabietic acid on mobile phase of different ratios

2.6 方法驗證

2.6.1 標準曲線、線性范圍與檢出限、定量限 將標準系列工作溶液采用1.2.3 節(jié)色譜條件以及1.2.4 節(jié)質(zhì)譜條件進行分析。采用內(nèi)標法定量，以脫氫松香酸定量離子峰面積與內(nèi)標物脫氫松香酸-6,6-D2定量離子峰面積比為縱坐標y，以脫氫松香酸質(zhì)量濃度（ng/mL）與內(nèi)標物脫氫松香酸-6,6-D2質(zhì)量濃度（ng/mL）比為橫坐標x，繪制標準曲線。得到線性回歸方程為y=0.02307x+0.09506，相關系數(shù)r為0.99977。脫氫松香酸目標物在5～400 ng/mL 范圍內(nèi)線性關系良好。采用空白樣品加標試驗確定檢出限和定量限，根據(jù)檢出限大于等于3 倍信噪比計算，得出脫氫松香酸的方法檢出限為80 μg/kg，根據(jù)檢出限大于等于10 倍信噪比計算，得出脫氫松香酸的方法定量限為200 μg/kg。

2.6.2 回收率和精密度 在確定的試驗條件下，分別取雞表皮組織和豬表皮組織2 種基質(zhì)，基質(zhì)中均不含本方法所檢測的目標物，向空白基質(zhì)中添加適量的目標物標準儲備液，使其折合成表皮組織中脫氫松香酸含量的水平為200、400、2000 μg/kg，每個添加水平重復6 次，測定加標回收率和精密度，結果見表2，脫氫松香酸在雞表皮組織和豬表皮組織基質(zhì)中3 個加標水平的平均回收率范圍為96.05%～104.17%，相對標準偏差（RSD）范圍為0.62%～3.68%，表明此方法有良好的準確性和重復性，符合畜禽表皮組織中脫氫松香酸測定的分析要求。

表2 脫氫松香酸的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 2 Recovery and repeatability (expressed as %RSD) results for dehydroabietic acid (n=6)

2.7 實際樣品分析

使用前述方法，檢測120 批次畜禽肉及其制品表皮組織中的脫氫松香酸含量，所檢樣品均來自于當?shù)鼐用袢粘ＯM的菜場、農(nóng)貿(mào)市場、超市等地，產(chǎn)品主要包括雞、雞翅、雞腿、豬尾、豬耳、鴨、鴨翅、鴨腿、鹵雞翅、鹵鴨翅、鹵雞腿、鹵鴨腿、鹵豬耳，其中20 批次樣品中檢出了脫氫松香酸殘留，殘留量檢出的產(chǎn)品主要集中在雞、雞翅和鴨，脫氫松香酸陽性樣品數(shù)量占樣本總量的16.67%，殘留含量范圍為390.15～1850.03 μg/kg，不符合國家的相關規(guī)定（國家食藥監(jiān)總局辦公廳關于工業(yè)松香脫毛有關問題的復函（食藥監(jiān)辦食監(jiān)二函〔2016〕476 號）：按照《食品安全國家標準食品添加劑標準（GB2760-2014）》和《畜禽屠宰衛(wèi)生檢疫規(guī)范（NY467-2001）》規(guī)定，松香甘油酯作為脫毛劑，可用于畜禽脫毛處理工藝，工業(yè)松香不可用于畜禽屠宰拔毛操作），陽性樣品檢測結果見表3。其中陽性樣品-16 中目標物提取離子色譜圖見圖10。

表3 陽性樣品分析結果（n=3）Table 3 Dehydroabietic acid content in positive samples (n=3)

圖10 陽性樣品-16 中目標物提取離子色譜圖Fig.10 Extracted ion chromatograms for dehydroabietic acid in positive sample-16

3 結論

本實驗針對畜禽樣品中的脫氫松香酸提取技術和測定方法進行了研究，確定了最佳的分析測定條件，該法易操作、重現(xiàn)性好、靈敏度高、準確性好，能較好實現(xiàn)對實際樣品的測定。通過對畜禽樣品中脫氫松香酸含量的測定，發(fā)現(xiàn)部分樣品中存在脫氫松香酸殘留，且殘留量較高，含量范圍為390.15～1850.03 μg/kg，不符合國家的相關規(guī)定，為保障消費者安全，有必要加大對畜禽表皮組織中非法使用工業(yè)松香脫毛的監(jiān)測力度。本方法進一步規(guī)范了脫毛劑的使用，保護畜禽脫毛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，確保畜禽類及其制品的質(zhì)量安全。