楊針，張越岳，張文智，盧鵬

中國人民解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院，海南三亞 572000

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球居第5位，病死率居第2位［1-2］。多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時已進展至晚期，失去了手術(shù)切除的機會，而通常的治療手段如射頻、動脈栓塞等總體療效仍未能令人滿意［3］。近年來，以RNA干擾（RNAi）技術(shù)為代表的基因治療在腫瘤治療方面取得較大進步，其通過選擇性靶向干擾特定蛋白的表達來抑制腫瘤細胞的生長，已成為有希望的腫瘤治療策略之一［4］。c-Met是肝細胞生長因子的受體，在肝癌中高表達，與肝癌的增殖、分化和血管生成相關［5-6］，被認為是肝癌中有希望的潛在基因治療分子靶點。雖然RNAi在抗癌治療中應用潛力很強，但其在體內(nèi)半衰期短、缺乏靶細胞特異性且穿過細胞膜的轉(zhuǎn)運差［7-8］，應用受到限制。因此，必須選擇一種可穩(wěn)定攜帶小干擾RNA（siRNA）同時具有靶向運輸作用的載體。近年來，隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應用，醫(yī)用納米技術(shù)應用于腫瘤治療中，已成為新的研究熱點。因此，本研究的目的是構(gòu)建一種新穎可行的siRNA運載體，能將siRNA遞送到肝癌組織并能發(fā)揮RNAi作用抑制腫瘤生長。磁性納米顆粒（SPIO）是靶向治療的有效載體，具有獨特的磁導向性和表面效應，可通過特異性修飾將藥物選擇性地定位到病灶部位，從而提高藥物療效，被廣泛用于藥物的靶向運輸。通常siRNA與磁性納米顆粒均為負電荷，如何將二者有效結(jié)合成為潛在難點。聚乙烯亞胺（PEI）是一種人工合成的陽離子，帶有大量正電荷，通過正負電荷的相互作用與siRNA、SPIO結(jié)合，并可攜帶siRNA順利通過細胞膜進入胞質(zhì)中，從而發(fā)揮siRNA的RNAi作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)，半乳糖（Gal）修飾的SPIO可與肝癌細胞表面特異性表達的去唾液酸糖蛋白受體識別［10］，從而使SPIO被肝癌細胞特異性識別。2019年6月—2020年9月，我們以Gal、PEI修飾的SPIO（Gal-PEI-SPIO）［11］為載體，觀察其介導的c-Met siRNA的抗肝癌細胞效應。

1 材料與方法

1.1 主要材料 肝癌細胞系MHCC-97H（美國ATCC公司），細胞培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Hyclone公司）；TRIzol RNA分離試劑（美國Invitrogen公司），SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE公司），氯仿，PCR試劑盒（Prime ScriptTMKit Reagent Kit with gDNA Eraser），CCK-8試劑（南京碧云天公司），共聚焦激光掃描顯微（CLSM，日本Olympus公司），凝膠成像儀（Chemi Doc MP System，美國BioRad公司）；c-Met siRNA的序列為5"-CCACGTGAACGCTACTTAT-3"，NCsiRNA的序列號siN05815122147，均由廣州銳博公司合成。

1.2 Gal-PEI-SPIO與siRNA的結(jié)合效率觀察 采用瓊脂糖凝膠電泳實驗。將Gal-PEI-SPIO與siRNA按SPIO與siRNA不同質(zhì)量比混合，室溫孵育30 min以形成Gal-PEI-SPIO/siRNA復合物。通過3%瓊脂糖凝膠電泳檢測Gal-PEI-SPIO與siRNA的結(jié)合，若在瓊脂糖凝膠的圖像中缺少條帶，表明siRNA與Gal-PEI-SPIO緊密結(jié)合。

1.3 Gal-PEI-SPIO對MHCC-97H的細胞毒性檢測 采用CCK-8法。將MHCC-97H細胞接種96孔板并培養(yǎng)24 h，將Gal-PEI-SPIO/NCsiRNA按不同濃度轉(zhuǎn)染細胞；培養(yǎng)24 h后用CCK-8試劑檢測細胞存活率，從而評價不同濃度Gal-PEI-SPIO與siRNA復合物的細胞毒性。

1.4 Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA納米復合物在MHCC-97H細胞中的沉默效率觀察

1.4.1 c-Met mRNA檢測 采用q-PCR法。將MHCC-97H細胞以2×105/孔接種6孔板，每孔中加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后用等量無血清的DMEM培養(yǎng)基沖洗替換培養(yǎng)基，將含Gal-PEI-SPIO與c-Met siRNA/NCsiRNA納米復合物分別加入不同的孔中，37℃孵育6 h。然后用含血清培養(yǎng)基代替轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，將細胞在37℃孵育24 h。用TRIzol試劑充分裂解細胞，收集細胞的總RNA；按照Prime ScriptTMRT試劑盒說明將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并使用qPCR定量分析結(jié)果。c-Met引物序列：上游為5"-ATCTCGGAGCCACAAACTA‐CA-3"，下游為5"-CAGTCCCGACAAGGTAAACAAT-3"；內(nèi)參β-actin引物序列：上游為5"-CATCCGTA‐AAGACCTCTATGCCAAC-3"，下游為5"-ATGGAGC‐CACCGATCCACA-3"。

1.4.2 c-Met蛋白檢測 采用Western blotting法。Gal-PEI-SPIO與c-Met siRNA/NCsiRNA納米復合物按照“1.4.1”轉(zhuǎn)染MHCC-97H細胞48 h，用PBS洗滌干凈后放置冰上；加入蛋白裂解液，使蛋白裂解液與細胞層面充分接觸；加入5×loading buffer，混勻后煮沸10 min，然后-20℃保存。通過8%SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)樣品，將含有目的條帶蛋白的PVDF膜分別與小鼠抗β-actin抗體（1∶2 000）和小鼠抗c-Met抗體（1∶1 000）在4℃搖床過夜孵育。吸去一抗溶液后用TBST溶液充分洗滌，將膜與辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000）在搖床上室溫孵育1 h。使用發(fā)光液檢測試劑檢測PVDF膜上的蛋白信號強度，并用Imagine Lab進行圖像分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶吸光度比值表示目的蛋白相對表達量。

1.5 Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA納米復合物影響MHCC-97H細胞遷移和侵襲能力的觀察

1.5.1 遷移實驗 采用Transwell小室。Gal-PEISPIO與c-Met siRNA/NC siRNA納米復合物轉(zhuǎn)染MHCC-97H細胞，48 h后用胰蛋白酶消化并離心收集細胞；用DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，使用細胞計數(shù)儀調(diào)整細胞密度2×105/mL。將Transwell小室放入24孔板中，在下室中加入500μL含10%血清的細胞培養(yǎng)液，上室中加入Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA或NC siRNA納米復合物轉(zhuǎn)染后不含血清的MHCC-97H細胞懸液150μL。培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，晾干后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min。在400×顯微鏡下隨機選取6個視野，拍照并計數(shù)細胞總數(shù)，取均值即為遷移細胞數(shù)。

1.5.2 侵襲實驗 采用包被有基質(zhì)膠的Transwell小室，其他步驟同體外遷移實驗。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，數(shù)據(jù)比較行t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Gal-PEI-SPIO與siRNA的結(jié)合效率 瓊脂糖凝膠電泳實驗顯示，在Gal-PEI-SPIO和siRNA以SIPO、siRNA質(zhì)量比≥4∶1時，兩者可以緊密結(jié)合。見圖1。

圖1 Gal-PEI-SPIO與siRNA的結(jié)合情況（瓊脂糖凝膠電泳）

2.2 Gal-PEI-SPIO對MHCC-97H的細胞毒性 當在Gal-PEI-SPIO和siRNA以SIPO、siRNA質(zhì)量比≥4∶1時，MHCC-97H細胞存活率迅速降低，表明細胞毒性大。所以，我們選擇了SPIO、siRNA質(zhì)量比為4∶1作為實驗的最終比例。見圖2。

2.3 Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA納米復合物在MHCC-97H細胞中的沉默效率 轉(zhuǎn)染Gal-PEISPIO/c-Met siRNA納米復合物的MHCC-97H細胞中c-Met mRNA及蛋白表達量分別為0.625±0.047、0.315±0.015，均低于轉(zhuǎn)染Gal-PEI-SPIO/NCsiRNA納米復合物MHCC-97H細胞的1.092±0.058、1±0.082（P均＜0.01）。

圖2 Gal-PEI-SPIO納米載體對MHCC-97H細胞存活率的影響（CCK-8法）

2.4 Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA納米復合物對MHCC-97H細胞遷移和侵襲能力的影響 轉(zhuǎn)染Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA納米復合物的MHCC-97H細胞遷移和侵襲的細胞分別為（50.29±6.21）、（77.00±5.33）個，均低于轉(zhuǎn)染Gal-PEI-SPIO/NC siRNA納米復合物MHCC-97H細胞的（75.94±9.54）、（101.41±4.36）個（P均＜0.01）。見圖3。

圖3 Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA納米復合物對MHCC-97H細胞遷移和侵襲能力的影響

3 討論

目前，以RNAi為代表的基因治療技術(shù)已廣泛應用于腫瘤治療中，成為有希望的治療策略之一［12］；但受限于siRNA在體內(nèi)半衰期短、缺乏靶細胞特異性以及穿過細胞膜的轉(zhuǎn)運差等缺點，必須要選擇一種可穩(wěn)定攜帶siRNA同時具有靶向運輸作用的載體。醫(yī)用納米技術(shù)應用于腫瘤治療已成為研究熱點，同時為RNAi治療帶來希望。在本研究中，我們研究了一種新型的siRNA納米運載體。該運載體是基于Gal、PEI修飾的SPIO，可通過Gal特異性識別肝癌表面表達的去唾液酸糖蛋白受體，使得SPIO特異性地被肝癌細胞識別，從而將siRNA靶向作用到肝癌部位，降低對正常組織的損傷作用；同時能攜帶并保護siRNA順利通過細胞膜，將siRNA遞送到肝癌細胞胞質(zhì)中，從而發(fā)揮siRNA的RNAi作用來抑制腫瘤生長。瓊脂糖凝膠電泳實驗結(jié)果顯示，當SPIO與siRNA質(zhì)量比≥4∶1時，siRNA可完全與納米載體結(jié)合。同時，細胞活性檢測顯示，其質(zhì)量比≥4∶1時細胞活性顯著降低。因此，以SPIO與siRNA質(zhì)量比4∶1作為本實驗的轉(zhuǎn)染比例。

c-Met是細胞生長因子的受體，其在肝癌組織中高表達，與肝癌的增殖、轉(zhuǎn)移及血管生成等因素密切相關［13-14］。因此，c-Met基因也被認為是肝癌中有希望的基因治療潛在分子靶點。本課題設計了針對c-Met的siRNA，并通過q-PCR、Western blotting法檢測Gal-PEI-SPIO能否有效攜帶c-Met siRNA進入MHCC-97H細胞中發(fā)揮沉默效果；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Gal-PEI-SPIO可有效攜帶c-Met siRNA進入細胞，可顯著降低c-Met在肝癌細胞中的基因水平，并能在蛋白水平抑制c-Met形成。這充分說明了該納米載體可攜帶c-Met siRNA進入腫瘤細胞中，并發(fā)揮RNAi作用。此外，我們進一步驗證了Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA復合物可抑制肝癌細胞遷移、侵襲的能力。由此可見，我們研制的Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA復合物在體外對MHCC-97H細胞有顯著抗腫瘤活性，為肝癌的治療提供了新的靶向策略，并為其在體內(nèi)抗腫瘤活性的研究提供了重要基礎。