王立明,尚惺杰,朱雅碧,葉淑芳,劉央央,陳 勇

王立明,尚惺杰,朱雅碧,葉淑芳,劉央央,麗水市人民醫(yī)院消化內(nèi)科浙江省麗水市 323000

陳勇,麗水市蓮都區(qū)人民醫(yī)院普外科 浙江省麗水市 323000

0 引言

慢傳輸型便秘(slow transit constipation,STC)是常見的便秘類型,主要表現(xiàn)為結(jié)腸蠕動動力降低而致使結(jié)腸通過時間的延長并導(dǎo)致糞便滯留于結(jié)腸部[1].STC患者除自感腹脹腹痛外,還可出現(xiàn)惡心、頭暈等癥狀,嚴重者甚至可致腸梗阻、腸穿孔等危及事件[1,2].流行病學(xué)調(diào)查研究顯示,隨著人口老齡化的出現(xiàn)以及飲食結(jié)構(gòu)的改變,各類型慢性便秘的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢.STC不僅影響患者的生活質(zhì)量,甚至導(dǎo)致一系列精神心理問題和不良心血管事件[3].目前,STC的治療手段主要是手術(shù)或西藥(西沙比利等),但這些治療手段往往存在術(shù)后并發(fā)癥或不良反應(yīng),進一步增加患者的痛苦[2,4].而STC的病因復(fù)雜,發(fā)病過程中不僅有多種激素和神經(jīng)遞質(zhì)的參與,還會同時出現(xiàn)多種胃腸微結(jié)構(gòu)的異常,這導(dǎo)致了藥物的治療難度[5,6].近年來大量研究顯示,中醫(yī)藥、針灸、艾灸、按摩以及中藥貼敷等手段對STC的治療取得了一定的療效[7-9].故本研究擬通過STC大鼠模型,結(jié)合中醫(yī)對本病的認知及已有的研究成果,探討電針療法聯(lián)合傳統(tǒng)方劑六磨湯在STC中的治療作用,并從結(jié)腸動力學(xué)和水液代謝等方面分析其可能的作用機制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑:血清NO及eNOS檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;p-PI3K和PI3K抗體購自上海泊灣生物科技有限公司;p-AKT和AKT抗體購自美國Affinity Biosciences公司;AQP3、AQP8和AQP9抗體購自美國Santa Cruz公司;c-kit、SCF、β-actin和GAPDH抗體購自美國Abcam公司;復(fù)方苯乙哌啶片劑購自于常州康普藥業(yè)有限公司.六磨湯方劑出自《世醫(yī)得效方》,由我院中藥房提供并制備水煎劑(2 g/mL).

1.1.2 實驗動物:50只SPF級雄性SD大鼠(200±20 g)購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(浙)2019-0001],實驗動物均飼養(yǎng)在條件可控(室溫維持在22±2 ℃、濕度維持在50%-70%)的動物房.

1.2 方法

1.2.1 模型構(gòu)建和分組處理:大鼠應(yīng)用普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后完全隨機分為兩組:對照組(Con)10只,給予普通飼料正常喂養(yǎng);剩余40只給予含復(fù)方苯乙哌啶的飼料(8 mg/kg·d,連續(xù)飼養(yǎng)120 d)建立STC模型.隨后將造模成功的40只大鼠隨機分為模型組(STC,10只),電針治療組(EA,10只),六磨湯治療組(LMT,10只)以及電針和六磨湯聯(lián)合治療組(EA+LMT,10只).電針治療組大鼠選取支溝、足三里和上巨虛進行電針治療(2 Hz/100Hz疏密波,留針15 min,共15 d),六磨湯治療組每天灌胃六磨湯(10 ml/kg·d,共15 d),聯(lián)合治療組同時接受電針治療和六磨湯灌胃.STC組大鼠每天給予等體積生理鹽水灌胃.

1.2.2 大鼠一般行為觀察與檢測:每日按照肉眼主觀觀察大鼠的皮毛色澤、精神狀態(tài)(反應(yīng)和動作是否靈敏)、食納(攝食狀態(tài))和大便形態(tài),并記錄大鼠體重.在實驗結(jié)束時,按照客觀指標統(tǒng)計上述情況,客觀實驗描述如下:

皮毛狀態(tài)按照皮毛澤度和濃密程度評估,濃密光亮記2分,濃密無光澤記1分,稀釋枯黃記0分;精神狀態(tài)按照曠場實驗中大鼠活動度評估.首先將大鼠在安靜、無人的行為實驗室適應(yīng)20 min.然后將大鼠均放入曠場箱(100 cm×100 cm×50 cm;長×寬×高;箱底均分25個20 cm×20 cm的方格)的中間方格,用視頻記錄儀錄像9 min,并通過回放記錄大鼠中間3 min內(nèi)穿越的方格數(shù).大鼠活動度以3 min內(nèi)穿越的總方格數(shù)表示.

攝食和排便情況檢測:將大鼠轉(zhuǎn)移至代謝籠(每籠1只大鼠)中,允許大鼠自由活動.早上8:00放入50 g飼料,次日8:00收集稱量剩余飼料,并計算大鼠24 h攝食量(投放飼料量-剩余飼料量),大鼠食納欲望按照大鼠24 h攝食量(g)/體重(g)來評估.收集24 h內(nèi)的排便并計數(shù)排便粒數(shù).稱量糞便重量(記為濕重);隨后60 ℃烘箱內(nèi)烘干24 h,再次稱重(記為干重).糞便含水量(%)=(濕重-干重)/干重×100%.

1.2.3 小腸推進檢測:實驗結(jié)束時,大鼠禁食12 h,然后對大鼠灌胃10%活性炭混懸液,每只灌胃2 mL.30 min后,麻醉處死大鼠并暴露腹腔,將幽門至回盲部的小腸管取出并輕柔拉直,測量碳末推進長度(cm)和小腸管的總長度(cm).炭末推進率(%)=炭末推進長度/小腸管總長度×100%.

1.2.4 ELISA:麻醉后提取腹主動脈血液,室溫條件下,靜置30 min,隨后經(jīng)冷凍離心機以3000 rpm離心10 min收集血清.依據(jù)試劑盒操作說明書步驟,用ELISA法檢測血清中NO和eNOS的含量.

1.2.5 Western Blot:取各組大鼠結(jié)腸組織進行勻漿處理,并利用RIPA裂解液提取組織總蛋白.之后依據(jù)BCA蛋白定量試劑盒測定所提蛋白的濃度并定量.每個樣品取70 μg蛋白并加入4倍體積的蛋白上樣緩沖液,煮沸變性,經(jīng)小型垂直電泳裝置行10% SDS-PAGE電泳.隨后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜.取出PVDF膜置于5%脫脂乳中室溫封閉60 min.按抗體說明書推薦的濃度加入相應(yīng)的一抗,置于4 ℃冰箱中振搖孵育過夜.次日復(fù)溫并用TBST緩沖液漂洗,隨后加入相對應(yīng)的HRP標記二抗,室溫條件下振搖孵育90 min.再次用TBST緩沖液漂洗,并轉(zhuǎn)移至暗室中灑上ECL化學(xué)發(fā)光液顯影,利用膠片曝光目的條帶.沖洗后,采用Image J軟件對蛋白的表達進行半定量分析.

統(tǒng)計學(xué)處理 所得結(jié)果表示為均數(shù)±標準差(mean±SD),并利用Graphpad Prism 8統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析.多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOWA),多組數(shù)據(jù)間均數(shù)的兩兩比較選用Bonferroni法.P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 電針聯(lián)合六磨湯對STC大鼠一般資料和排便情況的影響 一般行為資料觀察結(jié)果(表1)顯示,對照組大鼠精神狀態(tài)佳、皮毛柔軟光亮、食納佳;與對照組比較,STC模型組大鼠體型消瘦(體重顯著減輕)、皮毛枯黃稀疏(皮毛積分顯著降低)、食納不佳、精神萎靡(曠場試驗中大鼠跨越方格數(shù)顯著降低)、與STC模型組比較,電針治療組、六磨湯治療組以及聯(lián)合治療組大鼠體重明顯增加、皮毛積分升高、食納欲增加、精神狀態(tài)轉(zhuǎn)好.大鼠排便情況的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示(表2),與Con組比較,STC組大鼠24 h排便粒數(shù)和糞便含水率均顯著降低;此外,小腸碳末推進率顯著減慢.與STC組相比,電針治療、六磨湯治療以及聯(lián)合治療均可顯著增加大鼠24 h排便粒數(shù)和糞便含水率;同時加快小腸碳末推進率.此外,相較于電針或六磨湯單一治療,聯(lián)合治療的效果更為顯著.

表1 各組大鼠的一般行為資料結(jié)果比較

表2 電針聯(lián)合六磨湯對慢傳輸型便秘大鼠排便情況的影響

2.2 電針聯(lián)合六磨湯對STC大鼠結(jié)腸組織中c-kit和SCF表達的影響 Western blot實驗結(jié)果顯示,與Con組相比,STC組大鼠結(jié)腸組織中c-kit及其配體SCF的蛋白表達水平顯著降低;與STC組比較,電針治療、六磨湯治療以及聯(lián)合治療均可顯著上調(diào)大鼠結(jié)腸組織中c-kit及其配體SCF的蛋白表達水平.相較于EA和LMT組,EA+LMT組大鼠結(jié)腸組織中c-kit和SCF的蛋白表達水平顯著升高(圖1).

圖1 電針聯(lián)合六磨湯對慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸組織中c-kit 和 SCF表達的影響.n=10.mean±SD,aP＜0.05 vs Con組;bP＜0.05 vs STC組;cP＜0.05 vs EA+LMT組.

2.3 電針聯(lián)合六磨湯對STC大鼠血清NO和eNOS含量的影響 ELISA檢測結(jié)果(圖2)顯示,與Con組相比,STC組大鼠血清中NO和eNOS的含量顯著增加(P＜0.01);與STC組比較,EA和LMT組大鼠血清中NO和eNOS水平未出現(xiàn)顯著變化,而EA+LMT組大鼠血清中NO和eNOS水平顯著降低.

圖2 電針聯(lián)合六磨湯對慢傳輸型便秘大鼠血清中NO和eNOS水平的影響.A:NO;B:eNos.n=10.mean±SD,aP＜0.05 vs Con組;bP＜0.05 vs STC組.

2.4 電針聯(lián)合六磨湯對STC大鼠結(jié)腸組織PI3K/AKT信號通路的影響 Western blot實驗結(jié)果顯示,與Con組相比,STC組大鼠結(jié)腸組織中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的表達水平顯著降低;與STC組比較,電針治療、六磨湯治療以及聯(lián)合治療均可顯著促進大鼠結(jié)腸組織中PI3K和AKT的磷酸化.相較于EA和LMT組,EA+LMT組大鼠結(jié)腸組織中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的表達水平顯著升高(圖3).

圖3 電針聯(lián)合六磨湯對慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸組織PI3K/AKT信號通路的影響. n=10.mean±SD,aP＜0.05 vs Con組;bP＜0.05 vs STC組;cP＜0.05 vs EA+LMT組.

2.5 電針聯(lián)合六磨湯對STC大鼠結(jié)腸組織中AQP3、AQP8和AQP9表達的影響 Western blot實驗結(jié)果顯示,與Con組相比,STC組大鼠結(jié)腸組織中AQP3、AQP8和AQP9的蛋白表達水平顯著升高;與STC組比較,電針治療、六磨湯治療以及聯(lián)合治療均可顯著下調(diào)大鼠結(jié)腸組織中AQP3、AQP8和AQP9的蛋白表達水平.相較于EA和LMT組,EA+LMT組大鼠結(jié)腸組織中AQP3、AQP8和AQP9的蛋白表達水平顯著降低(圖4).

圖4 電針聯(lián)合六磨湯對慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸組織中AQP3、AQP8和AQP9表達的影響.n=10.mean±SD,aP＜0.05 vs Con組;bP＜0.05 vs STC組;cP＜0.05 vs EA+LMT組.

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療便秘中有著獨特的優(yōu)勢和較好的治療效果,且近年來,中醫(yī)藥和針灸療法在人群中逐漸推廣開來,給STC這種慢性復(fù)雜性疾病的治療提供了更多的治療手段.本研究依據(jù)前期的實驗結(jié)果制定了電針取穴聯(lián)合傳統(tǒng)方劑六磨湯的綜合調(diào)理方案.根據(jù)“和治內(nèi)腑”的理論,選取支溝(便秘要穴)、足三里(胃的下合穴)和上巨虛(大腸的下合穴)進行電針治療.六磨湯則是出自《世醫(yī)得效方》治療便秘的傳統(tǒng)方劑,主要由大黃、木香、烏藥、沉香、枳殼和檳榔組方,起到理氣導(dǎo)滯的功效.研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),電針、六磨湯以及電針聯(lián)合六磨湯治療均可以改善STC大鼠的精神狀態(tài),還可增加其24 h排便粒數(shù)和糞便含水率,同時加快小腸碳末推進率.相較于電針或六磨湯單一治療組,電針聯(lián)合六磨湯治療對于改善大鼠排便情況具有更好的效果.這一結(jié)果提示,電針與六磨湯可緩解STC,且兩者具有協(xié)同作用.

STC的病因復(fù)雜,目前對其發(fā)病機制的研究主要集中于腸道神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system,ENS)及神經(jīng)遞質(zhì)異常、胃腸運動的起搏細胞Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal,ICC)數(shù)量和結(jié)構(gòu)的改變、胃腸激素水平異常、腸道菌群失調(diào)以及精神心理因素等[4,10-12].其中,ICC是位于胃腸道環(huán)形肌層和縱行肌層之間的一群間質(zhì)細胞,可調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌的運動[4].Wang等[13]的研究表明,STC便秘患者的結(jié)腸ICC密度顯著降低,且基膜消融,突起間連接雜亂,不能形成完整的網(wǎng)絡(luò).C-kit則是ICC膜上特異性表達的一種酪氨酸激酶受體;可通過與配體SCF的結(jié)合進一步啟動下游信號通路,調(diào)控ICC的生長發(fā)育并維持其表型[14].本研究發(fā)現(xiàn),電針及六磨湯治療可顯著上調(diào)STC大鼠結(jié)腸組織中c-kit及其配體SCF的蛋白表達水平,且兩者對于c-kit和SCF表達的調(diào)控具有協(xié)同作用.結(jié)果表明,電針聯(lián)合六磨湯緩解STC可能與調(diào)控ICC的生長發(fā)育相關(guān).

此外,STC與ENS和神經(jīng)遞質(zhì)的失調(diào)具有密切的關(guān)系.NO是ENS中一種主要的抑制性遞質(zhì),可通過減少腸道平滑肌細胞內(nèi)的Ca2+濃度抑制細胞收縮,減弱腸道蠕動[15].而eNOS則是合成內(nèi)源性NO的主要限速酶,研究表明,通過下調(diào)NOS抑制NO的產(chǎn)生是緩解便秘的可行途徑之一[16].本研究發(fā)現(xiàn),電針聯(lián)合六磨湯治療可顯著降低STC大鼠血清中NO和eNOS水平.但電針或六磨湯單一治療對STC大鼠血清中的NO和eNOS水平影響并不顯著,可能是由于樣本量小的緣故.在調(diào)控eNOS合成的上游酶系中,PI3K/AKT信號通路是機體中研究較多,作用較明確的信號通路之一,它可廣泛參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡、代謝以及分化等病理生理過程[17,18].故而本研究進一步檢測了電針聯(lián)合六磨湯治療對PI3K/AKT信號通路的影響,結(jié)果顯示,電針及六磨湯可協(xié)同促進STC大鼠結(jié)腸組織中PI3K和AKT的磷酸化.

眾所周知,結(jié)腸中水液代謝異常也可導(dǎo)致糞便干結(jié),排出困難.水通道蛋白(AQPs)是細胞膜上的一種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白,主要負責(zé)介導(dǎo)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運,其中在哺乳動物的消化系統(tǒng)中存在AQP1、AQP3、AQP4、AQP8、AQP9、AQP10等9種AQPs的表達[19].越來越多的研究也證實結(jié)腸中AQPs的異常表達與STC的發(fā)生密切相關(guān)[20,21].本研究發(fā)現(xiàn),電針及六磨湯可協(xié)同降低STC大鼠結(jié)腸組織中AQP3、AQP8和AQP9的蛋白表達水平.結(jié)果提示,該電針聯(lián)合六磨湯治療方案可能通過減少水通道蛋白的表達,抑制結(jié)腸中水分的重吸收,增加糞便含水量,從而改善便秘癥狀.

4 結(jié)論

綜上,電針聯(lián)合六磨湯可顯著改善STC大鼠的癥狀.且,這種治療作用主要體現(xiàn)在:促進小腸推進,調(diào)節(jié)便秘大鼠的小腸傳輸功能;上調(diào)SCF/c-kit信號通路促進ICC數(shù)量,影響結(jié)腸的慢波電位,增加腸道動力;通過PI3K/AKT信號通路抑制NOS合成NO,促進胃腸蠕動;抑制水通道蛋白的表達,調(diào)節(jié)水液代謝,增加糞便的含水量.

文章亮點

實驗背景

隨著人口老齡化進程的加快以及飲食結(jié)構(gòu)的改變,慢傳輸型便秘(slow transit constipation,STC)的發(fā)病率也呈增加趨勢.但,目前常用的STC治療策略的療效差強人意,且存在明顯的不良反應(yīng).

實驗動機

中醫(yī)綜合療法對STC的治療取得了一定的療效,但尚未形成系統(tǒng)治療方案.

實驗?zāi)繕?/p>

通過建立STC大鼠模型,探討電針聯(lián)合六磨湯對STC的療效和機制.

實驗方法

將大鼠分為對照組,模型組,電針治療組,六磨湯治療組和電針+六磨湯聯(lián)合治療組.觀察大鼠的一般行為和排便情況.收集大鼠的血液樣本和結(jié)腸組織,用于后續(xù)的ELISA檢測和Western blot分析.

實驗結(jié)果

電針和六磨湯在改善STC大鼠的癥狀方面具有協(xié)同治療作用.機制研究顯示,電針和六磨湯能協(xié)同上調(diào)結(jié)腸組織中SCF、c-kit、p-PI3K和p-AKT的蛋白表達,下調(diào)AQP3、AQP8和AQP9的蛋白表達.

實驗結(jié)論

電針聯(lián)合六磨湯聯(lián)合治療方案可通過調(diào)節(jié)水液代謝、增加胃腸動力以及促進胃腸蠕動來改善STC大鼠的癥狀.

展望前景

電針聯(lián)合六磨湯聯(lián)合治療方案是潛在的且有前景的用于STC治療的方案.