樓何飛,馬春梅,傅英芝,張 術(shù)

樓何飛,馬春梅,傅英芝,磐安縣中醫(yī)院檢驗(yàn)科 浙江省金華市 322300

張術(shù),杭州市第二人民醫(yī)院 浙江省杭州市 310015

0 引言

大腸癌是全世界范圍內(nèi)最常見惡性腫瘤之一,據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,此疾病是男性第3位,女性第2位的常見惡性腫瘤[1].大腸癌早期缺乏特異性癥狀,多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)展至中晚期,而早發(fā)現(xiàn)、早確診、早治療是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié).有研究顯示,一次性篩查可將篩查群體大腸癌累積病死率降低10%以上[2].目前結(jié)腸鏡檢查及組織病理學(xué)檢查是臨床診斷大腸癌“金標(biāo)準(zhǔn)”,但此疾病早期無癥狀或癥狀不明顯,如何通過簡單、患者易接受的手段篩查高危群體是當(dāng)前急需解決問題之一.腫瘤M2型丙酮酸激酶(tumor M2 pyruvate kinase,TU M2PK)是丙酮酸激酶同工酶主要成員,正常情況其以四聚體形式存在,但在惡性細(xì)胞中可轉(zhuǎn)化成二聚體,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[3];波形蛋白(Vimentin)是一種重要細(xì)胞骨架蛋白,主要在中胚層起源細(xì)胞內(nèi)表達(dá),主要功能是維持細(xì)胞完整性、影響細(xì)胞遷移、黏附等過程[4];環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是一種雙功能酶,具環(huán)氧化酶及過氧化氫酶活性.近年相繼有研究表明,TU M2PK、COX-2、Vimentin在肺癌、胃腸道惡性腫瘤中異常表達(dá),但其對大腸癌篩查價(jià)值如何鮮見報(bào)道[5,6].本研究嘗試分析膠體金法檢測大腸癌患者糞便中TU M2PK、COX-2、Vimentin表達(dá)及臨床意義,為臨床完善大腸癌診療機(jī)制提供參考.現(xiàn)報(bào)告如下.

1 材料和方法

1.1 材料 選取2013-01/2017-01我院124例大腸癌患者作為觀察組,同期41例結(jié)腸鏡檢查陰性者作為對照組.納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)結(jié)腸鏡檢查及組織病理學(xué)診斷確診;首次確診,入組前未經(jīng)相關(guān)治療;原發(fā)性大腸癌;對照組體健,無惡性腫瘤相關(guān)疾病;患者、家屬知情理解,簽署同意書.排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他惡性腫瘤疾病者;終末期患者;有精神、認(rèn)知功能缺陷者;不耐受結(jié)腸鏡檢查者.觀察組男73例,女51例,年齡43-79歲,平均(66.38±5.11)歲,有大腸癌家族史13例,不良生活習(xí)慣:喜肉食37例,喜油炸31例,吸煙58例.對照組男22例,女19例,年齡41-78歲,平均(65.29±5.30)歲,有大腸癌家族史3例,不良生活習(xí)慣:喜肉食10例,喜油炸8例,吸煙20例.兩組性別、年齡、有大腸癌家族史、不良生活習(xí)慣基礎(chǔ)資料均衡可比(P＞0.05).本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過.

1.2 方法 采用上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司膠體金法試劑盒測糞便中TU M2PK、COX-2、Vimentin表達(dá).采用糞便樣本獨(dú)立收集容器采集新鮮糞便樣本約5 g,加稀釋液,振蕩,靜置10 min,再次振蕩,肉眼確認(rèn)收集裝置凹槽內(nèi)無樣本殘留,取稀釋管,采用吸管吸取樣本稀釋液,垂直滴加4滴樣本于試紙圓形樣本孔中,等待5 min,確認(rèn)結(jié)果;結(jié)果判斷:視線垂直觀察結(jié)果顯示區(qū)測試線,與質(zhì)控線對照,若測試線清晰可見,即為陽性;若測試線較弱,保存圖像,與試劑盒附帶正常人質(zhì)控線閾值圖像對比,測試線較閾值圖像深則為陽性;若僅有質(zhì)控,無測試線,則為陰性.

1.3 觀察指標(biāo) (1)對比兩組TU M2PK、COX-2、Vimentin陽性表達(dá);(2)對比不同病理特征患者TU M2PK、COX-2、Vimentin陽性表達(dá)率;(3)統(tǒng)計(jì)大腸癌患者1年生存情況;(4)Cox回歸分析大腸癌患者生存情況;(5)生存曲線分析.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0處理數(shù)據(jù),計(jì)數(shù)資料以例數(shù)描述,采用χ2檢驗(yàn);COX回歸模型分析預(yù)后生存情況;Kaplan-Meier生存曲線分析TU M2PK、COX-2、Vimentin陽性表達(dá)與患者死亡的關(guān)系,采用Log-Rank檢驗(yàn).均采用雙側(cè)檢驗(yàn),α=0.05.

2 結(jié)果

2.1 兩組TU M2PK、COX-2、Vimentin陽性表達(dá) 觀察組TU M2PK、COX-2、Vimentin陽性表達(dá)率均高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).見表1.

表1 兩組TU M2PK、COX-2、Vimentin陽性表達(dá)對比[n(%)]

2.2 不同病理特征患者TU M2PK、COX-2、Vimentin陽性表達(dá)率 大腸癌患者TU M2PK、COX-2、Vimentin陽性表達(dá)在Dukes分期、分化程度方面相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),在性別、年齡、病灶部位、組織學(xué)類型及病灶大小方面相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05).見表2.

表2 不同病理特征患者TU M2PK、COX-2、Vimentin陽性表達(dá)率對比

2.3 大腸癌患者生存情況 不同Dukes分期、分化程度、TU M2PK、COX-2、Vimentin表達(dá)患者1年生存情況相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).見表3.

表3 大腸癌患者生存情況

2.4 大腸癌患者生存情況Cox回歸分析 納入Cox回歸分析,調(diào)整其他混雜因素后,Dukes分期B期HR值為3.774(95%CI為2.079-6.852),表示B期患者在某時(shí)刻死亡的危險(xiǎn)度是A期患者的3.774倍;C期HR值為4.433(95%CI為2.525-7.782),表示C期患者在某時(shí)刻死亡的危險(xiǎn)度是A期患者的4.433倍;D期H R值為5.536(95%CI為3.124-9.812),表示D期患者在某時(shí)刻死亡的危險(xiǎn)度是A期患者的5.536倍;分化程度中分化HR值為0.414(95%CI為0.245-0.698),表示中分化患者在某時(shí)刻死亡的危險(xiǎn)度是低分化患者的0.414倍;高分化HR值為0.295(95%CI為0.215-0.404),表示高分化患者在某時(shí)刻死亡的危險(xiǎn)度是低分化患者的0.295倍;TU M2PK表達(dá)HR值為5.006(95%CI為2.741-9.142),表示陽性患者在某時(shí)刻死亡的危險(xiǎn)度是陰性患者的5.006倍,COX-2表達(dá)HR值為4.997(95%CI為3.025-8.256),表示陽性患者在某時(shí)刻死亡的危險(xiǎn)度是陰性患者的4.997倍;Vimentin表達(dá)HR值為4.671(95%CI為2.857-7.637),表示陽性患者在某時(shí)刻死亡的危險(xiǎn)度是陰性患者的4.671倍.見表4.

表4 大腸癌患者生存情況Cox回歸分析

2.5 生存曲線 TU M2PK、COX-2、Vimentin陽性表達(dá)患者1年生存率低于陰性患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.338、5.070、9.968,P＜0.05).見圖1.

圖1 生存曲線.TU M2PK:腫瘤M2型丙酮酸激酶;COX-2:環(huán)氧化酶-2;Vimentin:波形蛋白.

3 討論

大腸癌是我國常見惡性腫瘤之一,也是近三十年發(fā)病率增加最快腫瘤之一,而如何加強(qiáng)大腸癌篩查,做到早發(fā)現(xiàn)、早治療是當(dāng)前急需解決問題之一[7].近年基于分子生物學(xué)快速發(fā)展,此技術(shù)已逐漸成為大腸癌診斷的一項(xiàng)新型無創(chuàng)檢測技術(shù),且有研究表明,與常規(guī)糞便隱血試驗(yàn)對比,具更高敏感性及特異性,但哪種指標(biāo)更具有應(yīng)用價(jià)值尚無定論[8].

目前有關(guān)大腸癌的研究較多,如:張鑫東等[9]提出常見腫瘤標(biāo)志物糖類抗原199、癌胚抗原表達(dá)與直腸癌轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,但根據(jù)研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn),其預(yù)測預(yù)后的敏感度、特異度一般.TU M2PK主要分布在細(xì)胞內(nèi)部,但隨細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤壞死等可被釋放入體液,并以無活性二聚體形式存在,因此,可在體液內(nèi)檢測到TU M2PK表達(dá),且有研究發(fā)現(xiàn),U M2PK在消化道腫瘤患者外周血及糞便內(nèi)高表達(dá),與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),且其已被明確作為外周血、糞便內(nèi)的腫瘤生物標(biāo)志物[10].Vimentin是中間絲結(jié)合蛋白家族主要成員,有研究顯示,其對應(yīng)基因啟動子的甲基化與其表達(dá)異常關(guān)系密切,此特征與癌前病變、大腸腫瘤等發(fā)生有關(guān)[11].Vimentin在糞便內(nèi)檢測敏感性高,作為大腸癌篩查分子標(biāo)志物具良好檢測性能,是首次應(yīng)用糞便DNA甲基化作為大腸癌診斷性檢測的靶基因.本研究采用膠體金法檢測大腸癌患者糞便中TU M2PK、Vimentin表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),二者陽性表達(dá)率達(dá)分別為64.52%,57.26%,均存在一定漏診、誤診情況,仍需繼續(xù)完善檢測機(jī)制.此外,正常情況COX-2在體內(nèi)維持相對穩(wěn)定狀態(tài),參與前列腺素生成及維持機(jī)體正常功能,但出現(xiàn)炎癥反應(yīng)及發(fā)生腫瘤時(shí),其表達(dá)顯著升高[12].現(xiàn)有研究顯示,COX-2在正常分化組織中幾乎無表達(dá),但在結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤組織內(nèi)呈特異性表達(dá)[13].本研究也發(fā)現(xiàn),觀察組糞便中COX-2陽性表達(dá)率62.09%高于對照組(P＜0.05).結(jié)合學(xué)者張翔、Lin等[14,15]研究分析,主要是因COX-2能參與細(xì)胞增殖、侵襲及抑制細(xì)胞凋亡等過程,具原癌基因活性,通過抑制CyclinD1等靶基因表達(dá)致細(xì)胞停滯在G0/G1期繼而妨礙細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期及有絲分裂期,阻斷分化過程.上述研究說明,TU M2PK、COX-2、Vimentin可能共同參與大腸癌發(fā)生過程,或可互為補(bǔ)充為臨床篩查大腸癌提供新視角.

本研究對不同病理特征患者TU M2PK、COX-2、Vimentin陽性表達(dá)率探討發(fā)現(xiàn),隨大腸癌Dukes分期升高,分化能力降低,上述指標(biāo)陽性表達(dá)率升高(P＜0.05),反映TU M2PK、COX-2、Vimentin可能同時(shí)參與大腸癌發(fā)展過程.此特征亦符合TU M2PK、COX-2、Vimentin病理生理作用,均參與、影響細(xì)胞分裂過程,或可為臨床評價(jià)大腸癌病情、患者生存情況提供參考[16,17].但還有研究指出[18],大腸癌患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸與病灶位置、組織學(xué)類型等多種因素有關(guān),是多過程、多因素共同作用的結(jié)果.本研究對比1年期不同生存情況患者一般資料未發(fā)現(xiàn)上述特征,繼續(xù)Cox回歸分析顯示,糞便中TU M2PK、COX-2、Vimentin陽性表達(dá)率每升高1個(gè)單位患者病死風(fēng)險(xiǎn)均增加4.6倍以上,客觀說明TU M2PK、COX-2、Vimentin是大腸癌發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素.進(jìn)一步Kaplan-Meier分析顯示,TU M2PK、COX-2、Vimentin陽性表達(dá)患者1年生存率低于陰性患者(P＜0.05),證實(shí)TU M2PK、COX-2、Vimentin表達(dá)水平與患者生存情況關(guān)系密切.但本研究不足之處在于隨訪時(shí)間較短,在闡明大腸癌患者生存情況與TU M2PK、COX-2、Vimentin間關(guān)系層面可能缺乏客觀性,仍需后期繼續(xù)探究.

4 結(jié)論

綜上可知,大腸癌患者糞便中TU M2PK、COX-2、Vimentin異常表達(dá),膠體金法檢測上述指標(biāo)對篩查大腸癌及評估患者生存情況具有潛在應(yīng)用價(jià)值.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

由于人們不良的飲食習(xí)慣和家族遺傳等原因,大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢.而且大腸癌發(fā)病早期癥狀不明顯,極易發(fā)展惡化.目前對于大腸癌的檢測主要依靠結(jié)腸鏡和病理學(xué),鑒于方法較繁瑣且有創(chuàng)傷風(fēng)險(xiǎn),自愿接受檢測的意愿不強(qiáng)烈.

實(shí)驗(yàn)動機(jī)

鑒于大腸癌檢測手段的局限性和體內(nèi)檢測的微創(chuàng)風(fēng)險(xiǎn),體外檢測不僅可以實(shí)現(xiàn)無創(chuàng),而且還能為檢測雙方帶來方便,提高高危人群的檢測意識和積極性.糞便是反映大腸狀態(tài)最直接、最靈敏的產(chǎn)物.作為體外檢測主流方法之一的膠體金具有操作方便、檢測效率高、檢測成本低的特點(diǎn).

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究的目標(biāo)是用無創(chuàng)的膠體金體外檢測方法探索大腸癌患者糞便中腫瘤M 2 型丙酮酸激酶(tumor M2-pyruvate kinase,TU M2PK)、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、波形蛋白(Vimentin)等相關(guān)因子含量的變化與其患病程度以及生存健康之間的關(guān)系,以期能夠?yàn)榧膊〉脑绨l(fā)現(xiàn)、早治療提供相關(guān)依據(jù).

實(shí)驗(yàn)方法

本研究采用膠體金檢測糞便中相關(guān)因子含量的方法,通過觀察和隨訪判斷患者的身體狀況和恢復(fù)情況,最后用統(tǒng)計(jì)學(xué)回歸分析打方法分析糞便中與大腸癌患者病情關(guān)系密切的相關(guān)因子情況.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大腸癌患者TU M2PK、COX-2、Vimentin陽性表達(dá)率均高于陰性對照組,且不同Dukes分期、分化程度、TU M2PK、COX-2、Vimentin表達(dá)患者1年生存情況相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).TU M2PK、COX-2、Vimentin陽性表達(dá)患者1年生存率低于陰性患者.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

糞便中TU M2PK、COX-2、Vimentin的表達(dá)情況對大腸癌患者的生存期、Dukes分期、分化程度均有顯著的影響,為大腸癌的早期、快速診斷提供一定的借鑒意義.

展望前景

本研究雖然提供了快速檢測大腸癌患者病情的方法,但是也存在病例數(shù)不夠多、隨訪時(shí)間較短等問題,仍需后期繼續(xù)收集病例數(shù),增加隨訪時(shí)間等深入探究,在3個(gè)檢測指標(biāo)的基礎(chǔ)上繼續(xù)深入挖掘,發(fā)現(xiàn)更多更靈敏的檢測指標(biāo).