程維金 羅治建 陳亮 丁強(qiáng) 張叔勇

摘 要： 采用松材線蟲(chóng)的核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列及cathepsin L-like cysteine proteinase為目的片段設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立了可特異性檢測(cè)松材線蟲(chóng)的雙基因PCR檢測(cè)法。利用這2對(duì)引物，松材線蟲(chóng)可擴(kuò)增出大小分別為490 bp及264 bp的產(chǎn)物，而其他對(duì)照組均無(wú)擴(kuò)增。此檢測(cè)方法經(jīng)過(guò)實(shí)際應(yīng)用檢驗(yàn)，靈敏度與常規(guī)PCR一致，而特異性更高，可以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)需求。

關(guān)鍵詞： 松材線蟲(chóng);雙基因PCR;檢測(cè)方法

中圖分類號(hào)：S43?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A?? 文章編號(hào)：1004-3020（2021）02-0060-04

Establishment of Two Gene-jointed PCR Detection Assay for

Bursaphelenchus xylophilus

Chen Weijin（1） Luo Zhijian（2） Chen Liang（2） Ding Qiang（3） Zhang Shuyong（4）

（1.Wuhan Forestry Station Wuhan 430023;2.Hubei Provincial General Station of Forest Pest Control and Quarantine Wuhan 430079;3.Wuhan Baolvfeng Biotechnology Co.Ltd. Wuhan 430048;4.Wuhan Institute of Virology，CAS Wuhan 430071）

Abstract： In this paper，a new two gene-jointed PCR detection assay to detect Bursaphelenchus xylophilus，was established.For developing the two gene-jointed PCR detection of B.xylophilus，two pairs of primers were designed according to sequence of B.xylophilus available in GenBank，targeting the cathepsin L-like cysteine proteinase gene and ribosomal DNA internal transcribed spacer region.The specificity，sensitivity assay and clinical samples were tested by using the optimized reaction system.Results showed that the specific fragments 490 bp and 264 bp were able to amplified，while there was no amplification product found in positive controls and other tested ones.The method was applied to detect clinical samples and the result showed 100 % consistence with PCR.These results could be served as a basis detection application in diagnosis of B.xylophilus.

Key words： Bursaphelenchus xylophilus;two gene-jointed PCR;detection

松材線蟲(chóng)?。≒inewilt disease）是危害松屬植物的一種毀滅性病害，以松樹(shù)萎蔫病為典型癥狀，具有發(fā)病致死速度快、傳播蔓延迅速、防治難度大等特點(diǎn)[1]。該病由松材線蟲(chóng)Bursaphelenchus xylophilus引起，該病主要通過(guò)人為調(diào)運(yùn)帶疫的苗木、松木制品等進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，目前最主要的防治措施是通過(guò)設(shè)立和建設(shè)無(wú)病區(qū)，加強(qiáng)植物檢疫，嚴(yán)防病原傳入。其中，加強(qiáng)松材線蟲(chóng)的早期診斷和檢測(cè)技術(shù)的研究尤為重要。

雙基因聯(lián)合PCR擴(kuò)增是一種特殊的多重PCR擴(kuò)增技術(shù)[2]。該檢測(cè)技術(shù)主要選定兩個(gè)不同的靶基因分別進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì)，然后同時(shí)利用兩對(duì)特異引物對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化、擴(kuò)增，從而建立起兩個(gè)互不干預(yù)的檢測(cè)體系。雙基因聯(lián)合PCR擴(kuò)增與常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)相比，2個(gè)基因的檢測(cè)結(jié)果可以相互印證，有效減少了假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，具有更高的準(zhǔn)確性。

本試驗(yàn)根據(jù)松材線蟲(chóng)的核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列及基因組cathepsin L-like cysteine proteinase基因的特定區(qū)域進(jìn)行兩對(duì)特異性引物的設(shè)計(jì)，并成功建立了松材線蟲(chóng)雙基因聯(lián)合快速檢測(cè)體系，此檢測(cè)方法經(jīng)過(guò)實(shí)際應(yīng)用檢驗(yàn)，靈敏度與常規(guī)PCR一致，而特異性更高，可以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)。這為松材線蟲(chóng)早期診斷提供了有效方法，同時(shí)為該病害的準(zhǔn)確防治提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試線蟲(chóng)及松木樣品：松材線蟲(chóng)病木樣本由保綠豐（湖北）生物科技有限公司于2019年夏采集自武漢黃陂、馬鞍山森林公園等地;擬松材線蟲(chóng)、腐生性線蟲(chóng)病木樣本采集自武漢馬鞍山森林公園等地;

試劑：引物由華大基因有限公司武漢分公司合成。Taq DNA聚合酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DL2000 DNA Marker等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

線蟲(chóng)分離：新鮮采集的松木樣品，采用貝爾曼漏斗法在浸泡4～24 h后，收集前段濾液。樣品濃度不足時(shí)，濾液以1000 rpm離心10 min，棄上清，沉淀溶解于少量生理鹽水中。

DNA提?。猴@微鏡下挑取單條線蟲(chóng)或直接取多條線蟲(chóng)混合濾液，加入100 μ1松材線蟲(chóng)組織裂解液（2.5 mmol/L DTT、1.125% Tween20、0.025% Gelatin緩沖液）在冰上混勻，搗碎勻漿;55 ℃靜置15分鐘。-20 ℃長(zhǎng)期保存。

引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank上公布的線蟲(chóng)核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列及基因組cathepsin L-like cysteine proteinase基因分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其序列為：

BxF2：5′-CGAGCAGAAACGCCGACTT-3′

BxN2：5′-AACAAACCGCAGCCAGGACTC-3′

BxCPF：5′-ACTCGGCGGTGAAACTCCAT

BxCPR：5′-CACGCGACCATCTGCTCTTC

PCR擴(kuò)增：在PCR反應(yīng)管中加入2 μl上述提取的組織裂解提取液、1 μl上游引物、1 μl下游引物、1 μl dNTP（10mM）、5 μl 10×Taq酶緩沖液、2U Taq酶，加ddH2O至總體積為50 μl。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min 1個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min;共 35個(gè)循環(huán);72 ℃ 延伸 7 min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物置于-20 ℃保存。

引物特異性驗(yàn)證：分別采用基于線蟲(chóng)核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列引物對(duì)（BxF2+BxN2）及基于基因組cathepsin L-like cysteine proteinase基因的引物對(duì)（BxCPF+BxCPN），以及同時(shí)采用上述2對(duì)引物，對(duì)供試樣品經(jīng)行檢測(cè)。

電泳檢測(cè)：反應(yīng)結(jié)束后，取10μ1擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2 μl 6×DNA加樣緩沖液（含溴酚藍(lán)）混勻，在2%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠染色劑）電泳15分鐘。在紫外檢測(cè)儀下觀察、拍照。

序列測(cè)定及分析：PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)后回收，直接送樣單向及雙向測(cè)序。測(cè)序由華大基因公司武漢分公司完成。所得序列通過(guò)NCBI的Blastn進(jìn)行同源性分析。

雙基因聯(lián)合PCR擴(kuò)增體系實(shí)際應(yīng)用：分別從武漢市各區(qū)包括武漢黃陂、江夏、馬鞍山森林公園等地采集具有松樹(shù)萎蔫病癥狀的樣本，分離線蟲(chóng)后按照上述方法進(jìn)行雙基因聯(lián)合PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

在光鏡下，松材線蟲(chóng)呈蠕蟲(chóng)形，蟲(chóng)體細(xì)長(zhǎng)，長(zhǎng)1 mm左右。而腐敗生性線蟲(chóng)則比較短肥。松材線蟲(chóng)雌蟲(chóng)尾亞圓錐形，末端寬圓，少數(shù)有微小的尾尖突。雄蟲(chóng)交合刺大，弓狀，成對(duì)，喙突顯著，交合刺遠(yuǎn)端膨大如盤。根據(jù)雌蟲(chóng)的指形尾可以大致區(qū)分松材線蟲(chóng)與擬松材線蟲(chóng)。

2.2 PCR擴(kuò)增特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

基于線蟲(chóng)核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖中可以看出樣品在略大于264 bp處均出現(xiàn)一條清晰的主要擴(kuò)增帶，分子量大小與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物基本一致。

基于線蟲(chóng)cathepsin L-like cysteine proteinase基因設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。從圖2中可以看出樣品在略大于490 bp處均出現(xiàn)一條清晰的主要擴(kuò)增帶，分子量大小與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物基本一致。

應(yīng)用雙基因設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果與單一PCR結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，雙基因PCR結(jié)果與單一PCR檢測(cè)結(jié)果一致（圖3），表明該方法可以用作雙基因同時(shí)檢測(cè)出具檢測(cè)結(jié)果。

2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

基于線蟲(chóng)核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列引物對(duì)（BxF2+BxN2）及基于基因組cathepsin L-like cysteine proteinase基因的引物對(duì)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，切膠回收后，經(jīng)正反向測(cè)序，均得到與預(yù)期長(zhǎng)度一致的序列，經(jīng)Blastn進(jìn)行同源性分析，與預(yù)期基因相似性均為100%。

2.4 PCR擴(kuò)增實(shí)際應(yīng)用結(jié)果

采用PCR擴(kuò)增對(duì)來(lái)自武漢黃陂、江夏八分山、武漢馬鞍山森林公園等地的樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在武漢黃陂、江夏的樣本中均檢測(cè)到松材線蟲(chóng)陽(yáng)性。

3 討論

松材線蟲(chóng)在我國(guó)尚未得到有效控制，目前疫區(qū)仍在不斷擴(kuò)大之中。松材線蟲(chóng)的傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)具有一定的局限性，如特異性差、靈敏度低、依賴于檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)等等，難以對(duì)病害進(jìn)行早期快速準(zhǔn)確檢測(cè)。分子檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)逐步在各地得到一定的應(yīng)用。雖然目前已經(jīng)有熒光定量PCR等技術(shù)可在標(biāo)準(zhǔn)參考實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)松材線蟲(chóng)[3，4]，但是對(duì)人員及設(shè)備均有較高要求，各地林業(yè)部門仍然急需適用于基層，具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉、快速準(zhǔn)確的分子檢測(cè)技術(shù)。

基于線蟲(chóng)核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列是目前PCR擴(kuò)增技術(shù)主要的種類分子鑒定靶區(qū)，具有種內(nèi)變異較小而種間差別相對(duì)較大等優(yōu)點(diǎn)[5，6]，我們自行設(shè)計(jì)的引物對(duì)可以有效區(qū)分松材線蟲(chóng)、擬松材線蟲(chóng)及腐生線蟲(chóng);而基于基因組其它基因的擴(kuò)增技術(shù)則相對(duì)研究較少[7，8]，此前，松材線蟲(chóng)相關(guān)的雙重PCR技術(shù)也是根據(jù)線蟲(chóng)核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列設(shè)計(jì)[9]。因此我們根據(jù)線蟲(chóng)基因組cathepsin L-like cysteine proteinase基因的特定區(qū)域進(jìn)行了特異性引物的設(shè)計(jì)，結(jié)合基于線蟲(chóng)核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列引物對(duì)，成功建立了松材線蟲(chóng)雙基因聯(lián)合快速檢測(cè)體系。此檢測(cè)方法經(jīng)過(guò)實(shí)際應(yīng)用檢驗(yàn)，靈敏度與常規(guī)PCR一致，可以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)。

目前的松材線蟲(chóng)雙基因聯(lián)合快速檢測(cè)體系，在實(shí)驗(yàn)室采取的是經(jīng)典的瓊脂糖電泳的方法來(lái)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的檢測(cè)，在今后仍然有可能通過(guò)等溫?cái)U(kuò)增及顯色、雜交等可視化技術(shù)[10，11]，實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步升級(jí)，以滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。

參考文獻(xiàn)

[1]王玉嬿，宋玉雙，臧秀強(qiáng)，等.我國(guó)松材線蟲(chóng)病十年歷史回顧及今后防治對(duì)策[J].森林病蟲(chóng)通訊，1991（3）：39-42.

[2]Sergei A.Subbotin，Deliang Peng，Maurice Moens. A rapid method for the identification of the soybean cyst nematode Heterodera glycines using duplex PCR[J]. Nematology，2001，3（4）.

[3]陳鳳毛，葉建仁，吳小芹.松材線蟲(chóng)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)技術(shù)[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007（4）：121-124.

[4]郭立新，段維軍，顧建鋒，等.木質(zhì)包裝中松材線蟲(chóng)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)[J].植物保護(hù)，2011，37（5）：129-134.

[5]李一農(nóng)，余道堅(jiān)，李芳榮，等.松材線蟲(chóng)rNDA-ITS1區(qū)分子檢測(cè)與鑒定[J].植物保護(hù)，2004，30（3）：61-63.

[6]王仕利，曹福祥，王猛，等.松材線蟲(chóng)基因研究進(jìn)展[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，29（3）：195-198.

[7]陳鳳毛，葉建仁，吳小芹，等.松材線蟲(chóng)SCAR標(biāo)記與檢測(cè)技術(shù)[J].林業(yè)科學(xué)，2012，48（3）：88-94.

[8]葉碧歡，陳友吾，胡楊，等.兩種分子技術(shù)檢測(cè)松木中松材線蟲(chóng)的效果評(píng)價(jià)[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2018，45（6）：1335-1341.

[9]趙立榮，鐘國(guó)強(qiáng)，廖金鈴.Duplex PCR快速檢測(cè)松材線蟲(chóng)[J].植物檢疫，2004（6）：324-326.

[10]王熊，周鑫昱，史文強(qiáng)，等.一種松材線蟲(chóng)快速檢測(cè)的新技術(shù)[J].青島科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，40（3）：29-32，37.

[11]張?jiān)＞?，王金成，魏亞?wèn)|.可視化核酸試紙條法快速檢測(cè)松材線蟲(chóng)[J].植物保護(hù)，2013，39（4）：94-98.

（責(zé)任編輯：唐 嵐）