付海洋 于浩, 李敏, 姜愛莉 付步芳 王召旭

0 引言

透明質酸(hyaluronan，hyaluronic acid，HA)最早應用于眼科手術、骨科手術，預防術后粘連以及起到緩釋作用的藥物載體等方面[1]。交聯(lián)修飾之后的 HA通過提高分子量、改變水溶性、延長降解時間從而提高其臨床效果[2]。交聯(lián)后的成品因低免疫原性、較高安全系數(shù)、美容效果好、可在機體完全降解且不良反應發(fā)生概率低等優(yōu)勢，近年來在注射整形行業(yè)備受關注[3-4]。常見的交聯(lián)劑有二乙烯基砜(divinyl sulfone,DVS)[5]和1，4丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether ，BDDE)[6]。其中BDDE交聯(lián)劑因毒性較小、反應性好等優(yōu)勢，在整形手術用交聯(lián)透明質酸鈉凝膠中的應用十分廣泛，然而它卻具有易突變、易引起臨床不良反應，以及致癌的潛在因素，因此其交聯(lián)透明質酸中交聯(lián)劑含量過高同樣存在一定的安全性問題。BDDE的限量是BDDE-HA凝膠產(chǎn)品質量控制的關鍵指標之一，行業(yè)標準YY/T 0962—2014中規(guī)定BDDE交聯(lián)劑含量不得高于2 μg/g。

現(xiàn)行的YY/T 0962—2014《整形手術用交聯(lián)透明質酸鈉凝膠》行業(yè)標準推薦使用酶標儀檢測法和氣相法對BDDE交聯(lián)劑含量進行測定。但在常規(guī)的氣相法中，由于交聯(lián)透明質酸鈉凝膠產(chǎn)品大多都是顆?；镔|，BDDE交聯(lián)劑可能會殘留在顆粒內部，會對檢測結果造成干擾。在常規(guī)的酶標儀檢測法中，由于對樣品進行酶解所采用的透明質酸酶分子結構也含有環(huán)氧結構，會對檢測結果造成假陽性的影響，因此需要排除透明質酸酶的干擾作用。

基于上述分析，本文提出：針對氣相法首先采用透明質酸酶將樣品酶解，并用有機溶劑乙酸乙酯進行萃取，將處理后的樣品與2 μg/mL對照品溶液進行峰面積比較；酶標儀檢測法考慮透明質酸酶的影響，對方法進行改進，在標準溶液中也添加透明質酸酶，使標準溶液和樣品溶液都含有等量的酶，改進后的酶標法是一種更為精確測定交聯(lián)劑殘留量的檢測方法。通過上述方法，擬彌補現(xiàn)行行業(yè)標準YY/T 0962《整形手術用交聯(lián)透明質酸鈉凝膠》中方法的檢測缺陷，最后對這兩種改進后的方法進行方法學驗證，并組織多家實驗室進行驗證。

1 研究方法

1.1 現(xiàn)行檢測方法

氣相法：稱取交聯(lián)透明質酸鈉凝膠樣品4 g，置10 mL量瓶中，加丙酮適量后，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，未經(jīng)過酶解處理，難以檢測到樣品顆粒內部可能殘留的交聯(lián)劑。

酶標法：采用純化水配置0.5～80 μg/mL 的BDDE標準溶液，未考慮到透明質酸酶的干擾作用。

1.2 檢測方法的改良

1.2.1 實驗試劑與儀器

試劑：BDDE(含量95.0%)、苯乙酮(含量99.0%)、尼克酰胺(含量99.5%)、透明質酸酶(587 U/mg)，以上試劑由SIGMA公司提供。氫氧化鉀(含量>82%)、甲酸(含量>88%)、乙醇(含量>99.5%)，以上均為分析純，由國藥集團化學試劑有限公司提供。乙酸乙酯(色譜純)，由國藥集團化學試劑有限公司提供。交聯(lián)透明質酸鈉凝膠樣品(樣品1批號36923128、樣品2批號20190102、樣品3批號H190123B11A、樣品4批號20181224D)。

儀器：氣相色譜儀(島津公司，F(xiàn)ID檢測器，型號GC-2010 Plus)；熒光酶標儀(Molecular Devices公司，型號Spectra Max M5)；電子分析天平(Mettler-Toledo公司，型號XSE205DU)；恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司，型號SHHW21.420AII)；漩渦混合器(上海創(chuàng)萌生物科技有限公司，型號XW-80A)；冷凍離心機(日立公司，型號日立CR21G)。

1.2.2 氣相法

(1) 色譜條件 DM-17(30 m×0.32 mm×0.25 μm)毛細管柱，進樣口溫度260 ℃，分流比5∶1，檢測器溫度300 ℃，載氣為N2，流速為2.48 mL/min，柱溫采用程序升溫，初溫200 ℃，保持5 min，以20 ℃/min升至280℃，保持5 min，進樣體積2.0 μL。

(2) 溶液的配制 稱取25.56 mg的587 U/mg透明質酸酶用純化水定容至10 mL，配置1 500 U/mL的透明質酸酶溶液。

(3) 空白溶液和2 μg/mL BDDE標準溶液 分別將1.0 mL水、1.0 mL 2 μg/mL BDDE標準溶液轉移至一個10 mL的試管中，加入0.4 mL HAse溶液0.1 mL的水和1.0 mL乙酸乙酯，并充分混勻。將該溶液分裝在兩個微量離心管中，渦旋振蕩1 min，以14 000 r/min的轉速離心5 min，并將上清液轉移至自動進樣瓶中。

(4) 樣品溶液 在10 mL的試管中精密稱取大約1.0 g樣品，加入0.4 mL HAse溶液，再加0.1 mL的水，并置于37℃條件下水浴3 h，可每隔30 min定時進行渦旋振蕩，待樣品完全溶解，冷卻至室溫，加入1.0 mL乙酸乙酯。再按照1.2.2(3)條件處理樣品。

(5) 測定方法及指標 按照空白溶液、2 μg/mL BDDE標準溶液、樣品溶液的順序進樣，分別記錄色譜圖，按下式計算供試品中BDDE殘留量X。

(1)

式中：Cs為標準溶液BDDE濃度，μg/mL；Ai為供試品溶液中BDDE峰面積；As為標準溶液中BDDE峰面積；Wi為供試品稱樣量，g。

(6) 專屬性 專屬性指樣品中可能存在其他成分的情況下，所用分析方法能夠準確地、選擇性地檢測識別被測組分的能力。主要用于考察雜質及其他成分對待測組分測定結果的影響，可通過空白實驗來考察。

測試方法為分別量取空白溶液和10 μg/mL BDDE對照品溶液2 μL注入氣相色譜儀，按照1.2.2(1)色譜條件進行測定，記錄色譜圖。在待測組分出峰位置處，空白溶液并無干擾即為專屬性高。

(7) 精密度 取2 μg/mL BDDE標準溶液按照1.2.2(1)色譜條件連續(xù)測定6次，計算BDDE峰面積的RSD。

(8) 穩(wěn)定性 48 h內每隔8 h量取2 μg/mL BDDE標準溶液2 μL注入氣相色譜儀，按照1.2.2(1)色譜條件進行測定，記錄色譜圖，考察BDDE峰面積隨時間的變化趨勢，并計算RSD。

(9) 重復性 分別稱取6份1.0 g樣品1，按照1.2.2(1)色譜條件進行測定，記錄色譜圖，測定樣品中的BDDE殘留，并計算RSD。

(10) 定量限與檢出限 取10 μg/mL BDDE標準溶液，逐級稀釋成不同濃度的對照品溶液，依次測定，記錄BDDE峰的信噪比，以S/N=10時對應的濃度作為定量限，以S/N=3時對應的濃度作為檢出限。

(11) 回收率實驗 分別稱取3份1.0 g樣品1，加入0.4 mL HAse溶液，再分別加入0.1 mL濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL和40 μg/mL的BDDE溶液，并置于37℃水浴3 h，然后按照1.2.2(4)樣品處理方法進行操作并進行測定，計算加樣回收率及RSD。

(12) 樣品測定 分別稱取樣品1、樣品2、樣品3和樣品4各1.0 g，按照1.2.2(4)樣品處理方法進行操作，測定樣品中BDDE殘留。

1.2.3 酶標儀檢測法

(1) 溶液的配制 2.0 mg/mL BDDE標準儲備液，125 mmol/L尼克酰胺溶液，15%苯乙酮溶液，1 mol/L氫氧化鉀溶液，1 500 U/mL透明質酸酶溶液。

(2) 標準曲線的制作 實驗最佳條件的選擇，將透明質酸酶添加到標準溶液中。

標曲1(加酶)：取BDDE標準儲備液，用純化水精確配制濃度分別為16.0、8.0、4.0、2.0、1、0.5 μg/mL的BDDE溶液，分別取0.8 mL各濃度標準溶液加入等體積的1 500 U/mL透明質酸酶溶液，得到8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg/mL的BDDE標準溶液。

標曲2(不加酶)：取BDDE標準儲備液，用純化水精確配制濃度分別為8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg/mL的BDDE標準溶液。

(3) 樣品溶液 稱取0.8 g樣品(根據(jù)交聯(lián)透明質酸鈉凝膠的密度(1.01 g/mL)計算所取樣品的體積)，加入等體積的透明質酸酶溶液，37 ℃水浴搖床振蕩，24 h后獲得待測樣品酶解液。

(4) 測定方法及指標 量取各濃度標準溶液和待測樣品酶解液200 μL，加100 μL的125 mmol/L尼克酰胺溶液混合，在37℃下水浴120 min后，向其中加入1.0 mL的15%苯乙酮溶液和1.0 mL的1 mol/L氫氧化鉀溶液，混勻后置冰浴10 min。加入5.0 ml甲酸溶液，在60℃下水浴5 min，隨后在冰浴冷卻。在室溫下10～15 min后，用帶熒光檢測的酶標儀測定熒光值，激發(fā)和發(fā)射波長分別為370 nm和430 nm。記錄熒光強度檢測數(shù)據(jù)，然后以BDDE標準溶液濃度為橫坐標，熒光值為縱坐標，進行線性回歸。并按照1.2.3(2)標曲1進行方法學的驗證。

樣品溶液中交聯(lián)劑殘留量的濃度Ci計算：

Ci(μg/g)=MiV總/m

(2)

式中：Mi為根據(jù)標準曲線計算出的樣品溶液中BDDE的量，μg/mL；V總為樣品加酶液的總體積，mL；m為樣品的稱樣量，g。

(5) 精密度 取2.0 μg/mL對照品溶液按照1.2.3(4)方法并連續(xù)進行6次測定，記錄熒光強度，計算RSD。

(6) 穩(wěn)定性 取2.0 μg/mL對照品溶液按照1.2.3(4)方法，分別在0.25、0.5、1和2 h時測定熒光強度，計算RSD。

(7) 重復性 分別稱取6份0.8 g樣品1，按照1.2.3(4)方法連續(xù)進行6次測定，記錄熒光強度，計算RSD。

(8) 檢出限 連續(xù)進行10次空白測試，并按公式計算檢出限：

(3)

式中：QL為檢出限；S0為 10次空白測定的標準偏差；b為標準曲線斜率。

(9) 回收率實驗 分別稱取3份0.8 g樣品1[根據(jù)注射用交聯(lián)透明質酸鈉凝膠的密度(1.01 g/mL)計算所稱取樣品的體積]，分別加入20、40和60 μg/mL BDDE標準溶液各0.1 mL，然后加等體積的透明質酸酶溶液，水浴搖床37℃，轉速70 r/min，24 h后獲得注射用交聯(lián)透明質酸鈉凝膠酶解液，平行制備3份。然后按照1.2.3(4)測定方法進行試驗，計算加樣回收率。

(10) 樣品測定 分別稱取3份樣品1、樣品2、樣品3和樣品4各0.8 g，按照加酶的處理方法進行操作，分別依據(jù)標曲1和標曲2對樣品的BDDE含量進行計算，并取平均值。

1.3 實驗室驗證

由中國食品藥品檢定研究院進行方法建立，組織國內多家具有檢測資質的實驗室對該方法進行驗證，其中組織北京蒙博潤生物科技有限公司(實驗室M)和杭州協(xié)合醫(yī)療用品有限公司(實驗室X)，對本文提出的改良氣相測試方法進行驗證，按照1.2.2(1)～(5)的步驟開展重復工作，對同批次樣品1、樣品2進行交聯(lián)劑殘留量的測定，數(shù)據(jù)結果統(tǒng)一進行比較。組織實驗室M和上海其勝生物制劑有限公司(實驗室Q)采用酶標儀檢測法，按照1.2.3(1)～(4)的步驟開展同一方法的驗證工作，對同批次樣品1、樣品4進行交聯(lián)劑殘留量的測定，采用Minitab 16對數(shù)據(jù)結果進行統(tǒng)計學處理，對其進行雙因子方差分析。

2 實驗結果

2.1 氣相法

(1) 專屬性 圖1為本單位BDDE專屬性結果，顯示空白溶劑進樣，在BDDE出峰處無干擾峰，表明方法專屬性高。

圖1 空白溶劑及BDDE對照品溶液色譜圖

(2) 精密度 2 μg/mL BDDE標準溶液連續(xù)測定6次，BDDE峰面積RSD為6.62%(n=6)，可知方法精密度良好。

(3) 穩(wěn)定性 48 h內測定2 μg/mL BDDE標準溶液6次，BDDE峰面積無明顯變化趨勢，BDDE峰面積RSD為3.86%(n=6)，表明在該時間段內，配制的BDDE對照品溶液為穩(wěn)定狀態(tài)。

(4) 重復性 同一批次樣品按照該方法進行測定6次，均未檢測出BDDE殘留。

(5) 定量限與檢測限 BDDE定量限為1.80 μg/mL，檢出限為0.65 μg/mL。

(6) 回收率實驗 回收率均值為105.02%(n=6)，RSD為9.15%。

(7) 樣品測定 4個批次的樣品中均未檢出BDDE。

(8) 多家實驗室驗證結果 3家實驗室按照1.2.2(1)～(5)的方法對樣品1、2進行交聯(lián)劑含量測定。測定結果均是未檢出。

2.2 酶標儀檢測法

(1) 線性關系 標曲1(加酶)的回歸方程為y=36.89x+2.135(r=0.9989)，標曲2(不加酶)的回歸方程為y=35.518x-0.349(r=0.9990)，見圖2。結果顯示，是否在標準溶液中加酶并不干擾BDDE含量與熒光值的線性關系，加酶與不加酶都有很好的線性關系，都可以通過標準曲線進行計算。從標準曲線上看，加酶的方法可行。

圖2 對照品BDDE與熒光強度的線性關系

(2) 精密度 2 μg/mL BDDE標準溶液連續(xù)測定6次，熒光強度重復測定結果RSD為2.42%(n=6)，可知方法精密度良好。

(3) 重復性 樣品1按照該方法進行測定6次，重復測定結果RSD為2.19%(n=6)，可知重復性良好。

(4) 檢出限 10次空白測定熒光值分別為117.63、117.09、118.67、117.25、119.30、119.52、118.07、120.54、116.28、118.99，空白測定標準偏差為1.3020，標準曲線斜率為36.89，根據(jù)公式(3)計算檢出限，計算結果為0.106 μg/mL。

(5) 回收率實驗 根據(jù)標曲1(加酶)，得出回收率均值為97.43%(n=6)，RSD為8.22%；標曲2(不加酶)，回收率均值為107.23%(n=6)，RSD為8.32%。

(6) 樣品測定 由表1可見，根據(jù)標曲1(將酶添加到標準溶液)計算出的樣品含量明顯低于標曲2(不加酶)，這是因為此時扣除了樣品中透明質酸酶的影響，并且根據(jù)回收率實驗對比得出，將酶液添加到標準溶液中的最終測定結果更接近真實值。

表1 樣品中交聯(lián)劑含量

2.3 多家實驗室驗證結果

實驗室M和實驗室Q按照1.2.3(1)～(4)的實驗方法對樣品1、4進行BDDE殘留量測定(表4)，采用Minitab 16 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，采用雙因子方差分析，顯著水平P=0.113>0.05，因此得出多所實驗室對樣品1、4的測定結果不存在顯著性差異，結果表明該方法測定整形手術用交聯(lián)透明質酸鈉凝膠產(chǎn)品中的交聯(lián)劑含量具有可行性和可靠性。

表2 多所實驗室BDDE含量測定結果

3 討論

人體內將近一半的HA存在于皮膚的真皮內，為膠原纖維和彈性蛋白的分布提供空間，機體衰老的過程中，結締組織中的膠原蛋白和彈性纖維的網(wǎng)絡會分解，含量顯著下降，然而經(jīng)過向真皮層注射HA后，膠原纖維的含量明顯升高，由此證明注射HA可以調控膠原的合成，從而達到美容效果[7]。通過先進的交聯(lián)技術，改變HA凝膠的物理和化學性以達到預期目的，相較天然的HA，交聯(lián)后的凝膠衍生物結構強度以及抗酶解能力增強，從而延長在體內的維持時間。改性后的透明質酸生物膜還可以聯(lián)合氯雷他定片治療特應性皮炎[8]。本文采用氣相法和酶標儀檢測法對交聯(lián)劑BDDE的含量進行測定。

氣相法：BDDE交聯(lián)的透明質酸鈉凝膠產(chǎn)品，為不溶性凝膠狀，無法直接進樣，且產(chǎn)品大多都是顆粒化物質，BDDE可能殘存在顆粒內部，所以在進樣前首先需要對樣品進行酶解處理，然后添加乙酸乙酯萃取，高速離心后取上清液進行分析測定。設置低、中、高3個加標梯度，平均回收率為105.02%，RSD為9.15%，通過3家實驗室開展同一方法的驗證工作，測定結果均是未檢出。本文曾采用交聯(lián)產(chǎn)品中間體進行實驗，得到BDDE殘留量為4.84 μg/g，但由于交聯(lián)透明質酸鈉凝膠成品中BDDE含量很低，并且氣相法的定量限1.80 μg/mL十分接近最高標準要求，只能通過測定結果與2 μg/mL對照品溶液的色譜圖進行比對，進而確定殘留量小于2 μg/g。該方法操作簡單、快捷，為半定量測定方法，可作為標準檢測方法推廣應用。

酶標儀檢測法：該方法具有檢測靈敏度高、特異性強的優(yōu)勢。檢測原理為煙酰胺特異性地與BDDE中的環(huán)氧化合物的三元環(huán)發(fā)生反應，生成具有熒光吸收的有色物質，在一定的濃度范圍內，熒光強度與其含量呈一定線性相關性，通過熒光強度可計算成品中交聯(lián)劑的含量。然而透明質酸酶的分子結構中也含有環(huán)氧結構(本實驗使用的透明質酸酶來源于牛睪丸型)，這是檢測結果產(chǎn)生假陽性的原因，因此需要將透明質酸酶添加到標準曲線中，進而排除酶的影響，否則會造成檢測結果偏高。實驗過程中比較了是否添加透明質酸酶到標準溶液的數(shù)據(jù)結果，明顯得出考慮透明質酸酶的影響(將透明質酸酶添加到標準溶液)時，扣除酶對檢測結果的影響，計算交聯(lián)劑殘留量偏低，平均回收率為97.43%，RSD為8.22%，數(shù)據(jù)結果更為真實可靠。通過3家實驗室開展同一方法的驗證工作，對其檢測數(shù)據(jù)進行雙因子方差分析，測定結果不存在顯著性差異，得出本文建立的整形手術用交聯(lián)透明質酸鈉凝膠產(chǎn)品中交聯(lián)劑含量的酶標儀檢測法也具有可行性和可靠性，可作為標準檢測方法推廣應用。

4 結論

于2015年實施的YY/T 0962—2014 《整形手術用交聯(lián)透明質酸鈉凝膠》行業(yè)標準中推薦采用氣相法和酶標儀檢測法對交聯(lián)劑含量進行測定，兩種方法各有特點：氣相法操作簡單快捷，可作為BDDE的日常測定方法；酶標儀檢測法特異性更高，數(shù)據(jù)更為真實精確，可根據(jù)實際情況選擇具體采用哪種方法。

致謝：在此，十分感謝北京蒙博潤生物科技有限公司、上海其勝生物制劑有限公司和杭州協(xié)合醫(yī)療用品有限公司以及相關領域專家對行業(yè)標準《整形手術用交聯(lián)透明質酸鈉凝膠》行業(yè)標準交聯(lián)劑殘留量方面的修訂內容和補充驗證情況做出的努力。