文欣宜，蘇炳銀，李淑蓉△，韓玉萍△

1.成都醫(yī)學(xué)院 發(fā)育與再生四川省重點實驗室(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室(成都 610500)；3.成都醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室(成都 610500)

血腦屏障(blood brain barrier，BBB)是存在于血液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的屏障結(jié)構(gòu)，由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突、基底膜和周細(xì)胞組成[1]。BBB一方面起神經(jīng)保護(hù)作用，保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)較少被外來物質(zhì)侵?jǐn)_，維持高度的穩(wěn)態(tài)，同時為腦內(nèi)輸送營養(yǎng)物質(zhì)；另一方面，BBB也阻礙了用于腦部疾病診斷和治療的藥物通過非侵入性給藥方式進(jìn)入腦內(nèi)。因此，通過各種手段對藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)等方面的修飾，使藥物能夠穿越BBB[2]，進(jìn)入腦組織發(fā)揮藥效，是近些年研究者重點關(guān)注的方向。腦靶向生物相容性高的納米生物載體可以在分子水平上解決這個問題。

理想的腦靶向藥物系統(tǒng)包括治療性藥物、藥物載體、靶向分子三部分。姜黃素(curcumin, Cur)是從姜黃根莖中提取的一種多酚類物質(zhì)，有著廣泛的藥理作用，如抗炎、抗氧化，抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等[3-6]，近年來逐漸用于神經(jīng)退行性疾病的治療。然而，由于Cur在體內(nèi)半衰期短、口服吸收差、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，導(dǎo)致其生物利用度較低，限制了Cur在臨床上的運(yùn)用。半導(dǎo)體聚合物量子點(semiconducting polymer dots, Pdots)經(jīng)修飾后可用作靶向藥物載體，提高藥物的靶向運(yùn)輸能力，延長藥物的半衰期，增強(qiáng)藥物的治療作用，同時減小藥物的毒性。Pdots的疏水性使其具有載體屏蔽作用，藥物被包覆在Pdots內(nèi)部，或者與Pdots共價連接[7]?？袢〔《疽職ぶ邪惺壬窠?jīng)性蛋白質(zhì)(rabies virus glycoprotein, RVG)，能被神經(jīng)元表面表達(dá)的尼古丁乙酰膽堿受體特異性識別。在RVG的作用下，狂犬病病毒很容易越過BBB，侵襲腦組織和神經(jīng)中樞，引起狂犬病發(fā)作[8]。本研究通過構(gòu)建Pdots-RVG-Cur納米復(fù)合物以及體外BBB模型，探討Pdots-RVG-Cur穿透BBB靶向神經(jīng)元的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞系(MN9D)、小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系(b.End3)由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫提供，高糖DMEM、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(青霉素+鏈霉素)、0.25%胰酶均購自美國Gibco公司，超濾離心管(0.5 mL/100 kd)、0.22 μm親水PVDF微孔濾膜、懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室(PET 3 μm, 24-well)均購自美國Millipore公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、9,9-二辛基聚芴苯并噻二唑交替共聚物(F8BT)、四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)、Cur、多聚甲醛、聚苯乙烯-馬來酸酐 (poly styrene-co-maleic anhydride, PSMA)均購自德國sigma-aldrich公司，RVG29-Cys購自上海吉爾生化公司，抗熒光淬滅劑(4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)購自上海碧云天公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁公司，不含酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國博士德公司，熒光素鈉購自上海阿拉丁公司，鼠尾Ⅰ型膠原、細(xì)胞培養(yǎng)皿均購自美國Corning公司。

1.2 材料制備

1.2.1 Pdots的制備 采用納米共沉淀的方法制備Pdots。將0.75 mg共軛聚合物F8BT、0.187 mg兩親性聚合物PSMA溶解于3 mL THF，將混合液迅速加入正在超聲的雙蒸水中，繼續(xù)超聲20 min直至溶液澄清透亮。將溶液置于通風(fēng)櫥，通風(fēng)過夜以蒸發(fā)溶液中多余的THF。將得到的溶液用100 KDa超濾管離心提純。最后，將提純后的溶液通過0.22 μm的膜過濾得到濃度為250 mg/L的Pdots原液。密封，置于4 ℃冰箱避光保存。

1.2.2 Pdots-RVG的制備 將Pdots與RVG按照1∶1 000 mol/L比例混合，若要配置1 mL含Pdots-RVG的培養(yǎng)基，按照以下比例混合：Pdots原液100 μL、HEPES(1 mol/L) 15 μL、RVG(1 mmol/L)8.8 μL、含2% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基876.2 μL。按照順序依次加入，每步充分混合。其中，加入RVG后要充分混合20 min后再加入培養(yǎng)基。Pdots-RVG混合液現(xiàn)用現(xiàn)配，盡量避光操作。

1.2.3 Cur母液及Pdots-RVG-Cur的配制 Cur溶解于無水乙醇中，配制成濃度為10 g/L的Cur溶液。將合成好的Pdots-RVG與一定量的Cur溶液混合，室溫下?lián)u床輕微搖晃2 h以充分混勻，制備Pdots-RVG-Cur。

1.3 材料的表征

1.3.1 透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)下觀察納米顆粒的形態(tài) 取50 μL樣品滴加到銅網(wǎng)上，干燥后在TEM下對其形貌進(jìn)行表征。其中Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur經(jīng)過磷鎢酸染色。

1.3.2 動態(tài)光散射技術(shù)(dynamic light scattering, DLS)檢測納米顆粒粒徑及穩(wěn)定性分析 將樣品稀釋到合適的倍數(shù)，用納米粒度儀測量，采集數(shù)據(jù)，獲得其平均水力學(xué)直徑及多分散系數(shù)(particle dispersion index, PDI)。將樣品室溫放置24、48 h后采集數(shù)據(jù)。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞存活率

MN9D細(xì)胞和b.End3細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后分別接種于96孔板，分為空白組、對照組、實驗組，空白組不含細(xì)胞。實驗組分別加入含不同濃度Pdots-RVG混合液(Pdots濃度為10～50 mg/L，RVG的濃度按照方法1.2.2相應(yīng)增加)的培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h。吸除培養(yǎng)基，每個孔內(nèi)加入含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)基，避光孵育1.5 h。用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值，根據(jù)公式計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(A給藥-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

1.5 BBB體外模型的建立

取足夠數(shù)量的懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室置于24孔板內(nèi)。小室上層加100 μmol/L鼠尾膠原Ⅰ，濕潤小室20 min后吸出，超凈工作臺1級風(fēng)干6 h，風(fēng)干成膠。將b.End3接種在涂有鼠尾膠原Ⅰ的小室的PET膜上，小室下層加500 μL高糖DMEM培養(yǎng)基以高過PET膜水平面。接種細(xì)胞當(dāng)天，12 h后更換小室上層培養(yǎng)基，以后隔天換液。

1.6 BBB體外模型的評價

1.6.1 4 h滲漏實驗 細(xì)胞貼附在PET膜上后，在小室上層加入300 μL高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，在小室下層加入500 μL高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基以高過上層液面(具有>0.5 cm的液面差)。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，取出觀察小室上、下層液面差變化。當(dāng)4 h后液面差沒有明顯變化時，說明形成了較為致密的細(xì)胞層，行下步熒光素鈉(fluorescein sodiu,FLU)通透性實驗。

1.6.2 FLU通透性實驗 測定1.000、0.500、0.250、0.125、0.063 g/L FLU溶液在530 nm處的吸光度值，繪制FLU標(biāo)準(zhǔn)曲線。細(xì)胞小室上層加300 μL含1 g/L FLU的無酚紅DMEM培養(yǎng)基，下層加入無酚紅DMEM培養(yǎng)基，加入的量以保持上、下液面相平為準(zhǔn)。培養(yǎng)2 h后，分別從上、下室中取100 μL溶液，加入到96孔板中，酶標(biāo)儀測溶液在530 nm處的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算FLU濃度。以未加入b.End3細(xì)胞的小室作為空白對照組，4 h試漏實驗成功的b.End3細(xì)胞小室為模型組，比較兩組FLU通透率差異。小室FLU通透率=(下室FLU濃度×下室培養(yǎng)液體積)/(上層FLU濃度×上室培養(yǎng)液體積)×100%。

1.7 觀察BBB模型中MN9D細(xì)胞對藥物的攝取情況

將MN9D細(xì)胞接種于帶有細(xì)胞爬片的24孔板內(nèi)，將成功建立BBB體外模型的懸掛式細(xì)胞小室移至其內(nèi)(圖1)向小室上層分別加入DMEM/F12培養(yǎng)基、含20 μmol/L Cur的培養(yǎng)基、含相同Cur濃度的Pdots-RVG-Cur的培養(yǎng)基，共孵育48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，移去小室，MN9D細(xì)胞爬片PBS洗3次。4%多聚甲醛避光固定細(xì)胞20 min。將細(xì)胞爬片有細(xì)胞的一面朝下蓋在滴有抗熒光淬滅劑(含DAPI)的載玻片上，通風(fēng)櫥避光通風(fēng)，風(fēng)干后后立即用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)觀察。

圖1 體外BBB模型圖

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Pdots、Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur的表征

2.1.1 TEM下觀察納米顆粒的形貌 TEM下觀察Pdots的外貌呈相對均勻的球形，粒徑在0.10 μm左右。Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur同樣呈球形，粒徑分別在0.20、0.33 μm左右(圖2), 表明Pdots-RVG載藥結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定性。

圖2 TEMF觀察Pdots、Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur的形態(tài)

2.1.2 DLS測試納米顆粒粒徑及及穩(wěn)定性分析 PDI表示粒徑分布的離散程度，PDI越小，說明粒子大小分布越集中，粒徑表征時PDI的最佳范圍為0.08～0.70。測量Pdots、Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur的PDI分別為0.206、0.217、0.308,納米粒子分散均勻，粒徑測量結(jié)果可靠。Pdots平均粒徑為98.4 nm, Pdots-RVG平均粒徑為214.8 nm, Pdots-RVG-Cur平均粒徑為317.2 nm(圖3)。這與TEM下觀察到的粒子粒徑相符合。24、48 h再進(jìn)行DLS測量。結(jié)果顯示，隨著時間推移，Pdots、Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur的粒徑分別相對穩(wěn)定在95、250、320 nm左右，說明三者在溶液中穩(wěn)定性均良好(表1)。

圖3 Pdots、Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur的粒徑分布圖

表1 Pdots、Pdots、Pdots-RVG-Cur不同時間點的粒徑(nm)

2.2 納米材料的生物相容性

為了研究Pdots-RVG作為載藥體的細(xì)胞毒性，用濃度梯度的Pdots-RVG處理MN9D細(xì)胞和b.End3細(xì)胞48 h,用CCK-8分別檢測兩種細(xì)胞的存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增加，兩種細(xì)胞的存活率均下降。在10 mg/L時，MN9D細(xì)胞和b.End3細(xì)胞的存活率分別為95.1%、94.8%，均高于90.0%。當(dāng)藥物濃度達(dá)到50 mg/L時，MN9D細(xì)胞和b.End3細(xì)胞的存活率分別為84.5%、80.2%，仍高于80.0%(圖4)。Pdots-RVG表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性。

圖4 不同濃度Pdots-RVG對細(xì)胞的損傷作用

2.3 BBB體外模型的建立與評價

將b.End3細(xì)胞以每孔8×104個/cm2的密度接種在涂有鼠尾膠原Ⅰ的小室的PET膜上,12 h后光鏡下觀察到小室內(nèi)無懸浮細(xì)胞，說明細(xì)胞已貼附生長在PET膜上，此后每隔24 h行一次4 h試漏實驗。

2.3.1 4 h試漏實驗 細(xì)胞貼膜生長后，每隔24 h行1次4 h試漏實驗。觀察到在細(xì)胞接種第96 h時，4 h試漏實驗結(jié)果顯示，模型組小室內(nèi)外液面差在4 h后能保持相對穩(wěn)定，且>0.5 cm, 而未接種細(xì)胞的空白對照組4 h后，小室內(nèi)、外液面差消失，內(nèi)外液面齊平(圖5)。結(jié)果說明此時細(xì)胞已生長融合足夠緊密，形成了致密的細(xì)胞層，對液體有一定的屏障作用，阻隔了液體間的流動。將此小室用于下步FLU通透性檢測。

圖5 4 h試漏實驗

2.3.2 FLU通透性檢測 由FLU標(biāo)準(zhǔn)曲線可知， FLU濃度與其吸光度值有較好的相關(guān)性，可以通過吸光度值間接反映FLU的濃度(圖6 A)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及通透率計算公式計算兩組的通透率，模型組FLU通透率48.52%，對照組FLU通透率90.67%(圖6 B)。模型組通透性明顯低于空白對照組(P<0.001)，說明模型對小分子物質(zhì)具有一定的阻隔作用，模型組具有較低的通透性，體外BBB模型建立成功，用于下步細(xì)胞攝取Cur、Pdots-RVG-Cur的實驗。

圖6 熒光素鈉通透性測試

2.4 藥物透過BBB體外模型被神經(jīng)元攝取情況

將成功建立BBB體外模型的細(xì)胞小室移至種植有MN9D細(xì)胞的24孔板內(nèi)。向小室上層分別加入培養(yǎng)基、含Cur的培養(yǎng)基、含相同Cur濃度的Pdots-RVG-Cur的培養(yǎng)基，孵育48 h后，于CLSM下觀察MN9D細(xì)胞對藥物的攝取情況(圖7)。Cur和Pdots-RVG-Cur均能穿過BBB模型進(jìn)入小室下層被MN9D細(xì)胞攝取，且Pdots-RVG-Cur組細(xì)胞顯示出比相同濃度游離的Cur組細(xì)胞更強(qiáng)的紅色熒光。結(jié)果表明Pdots-RVG-Cur和游離的Cur均能透過體外BBB模型，用Pdots-RVG包裹Cur相比于游離Cur更容易被細(xì)胞攝取，Pdots-RVG增加了Cur的生物利用度；這可能是因為Pdots的包裹提高了疏水性Cur的溶解度和分散性，而RVG不僅能與神經(jīng)元上特異受體結(jié)合，使納米顆粒進(jìn)入神經(jīng)元，還可以介導(dǎo)納米顆粒穿過BBB。

圖7 CLSM下觀察體外BBB模型中MN9D細(xì)胞對藥物的攝取情況

3 討論

隨著我國人口老齡化程度逐年加重，阿爾茲海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病人群逐年增加[9-10]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療進(jìn)展緩慢，主要的障礙之一是由于血腦屏障限制了治療藥物向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的有效遞送。因此，開發(fā)各種載藥系統(tǒng)，使藥物能穿過血腦屏障進(jìn)入腦部病灶部位發(fā)揮療效是神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的研究熱點。

在靶向腦藥物的開發(fā)領(lǐng)域中，納米材料由于其生物學(xué)特性而具有獨(dú)特的優(yōu)勢。Pdots作為一種新型的納米探針，擁有作為藥物載體的開發(fā)潛力。首先，Pdots具有低毒性，較高的生物相容性，保證了其藥物安全性。其次，Pdots具有疏水性，可利用載體的屏蔽作用包裹并保護(hù)藥物。除此之外，Pdots表面帶電荷，使得其易于與藥物結(jié)合。同時，Pdots還擁有較高比表面積(即單位質(zhì)量物料所具有的總面積)，提示其作為藥物載體能獲得較高的藥物載量[11-18]。然而將其作為藥物載體的研究目前并不多。本研究選用Pdots作為藥物載體裝載靶向分子RVG以及治療性藥物Cur，通過本實驗驗證了Pdots具有較穩(wěn)定的載藥結(jié)構(gòu)、較低的細(xì)胞毒性以及較好的BBB穿透性。

開發(fā)有效的穿透BBB靶向腦的藥物遞送系統(tǒng)，除了要有藥物載體之外，還要有腦靶向遞送策略。藥物遞送入腦主要有以下3種方式：1)吸附介導(dǎo)的跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn);2)細(xì)胞穿膜肽介導(dǎo)的跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)；以上兩種方法都并不是特異靶向到腦部。3)受體或轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞實現(xiàn)跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)。RVG29是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種存在于狂犬病毒糖蛋白上一段29個氨基酸序列的多肽，該段多肽能被神經(jīng)元表面表達(dá)的尼古丁乙酰膽堿受體特異性地識別最終使得狂犬病毒穿過BBB[19-20]。本研究構(gòu)建的Pdots-RVG-Cur載藥系統(tǒng)中，RVG29作為靶向遞送分子，發(fā)揮了協(xié)助藥物穿透BBB，并增強(qiáng)神經(jīng)元對藥物的攝取的作用。

本研究通過構(gòu)建上層為BBB模型，下層為MN9D細(xì)胞的體系，探究向上層加藥物后，下層細(xì)胞內(nèi)是否能觀察到此藥物，以此模擬藥物在人體內(nèi)透過血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)元的過程。本實驗結(jié)果表明，Pdots-RVG-Cur和游離的Cur均能透過體外BBB模型，但用Pdots-RVG包裹Cur后，相比于游離Cur，穿透BBB并被細(xì)胞攝取Cur的量更多。這說明Pdots-RVG作為載藥體，提高了Cur的生物利用度，揭示Pdots的包裹提高了疏水性Cur的溶解度和分散性，從而提高Cur在溶液中的穩(wěn)定性。并且，RVG作為腦靶向分子，能夠增加藥物系統(tǒng)穿透BBB效率。

綜上所述，選用RVG29作為腦靶向分子，將其與作為載體的Pdots相連接，建立Pdots-RVG藥物遞送系統(tǒng)，并裝載神經(jīng)保護(hù)性藥物Cur，利用RVG29與BBB上受體結(jié)合介導(dǎo)的穿胞作用以及Pdots的藥物包封作用，實現(xiàn)將Cur載藥系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至腦部的效果，為后續(xù)開發(fā)Cur類神經(jīng)治療性藥物提供新的思路。