李晶峰,郅 慧,楊小倩,高 旭,張 輝,孫佳明

(長春中醫(yī)藥大學(xué),吉林長春 130117)

龜甲是中醫(yī)臨床常用的抗骨質(zhì)疏松藥物,具有滋養(yǎng)腎陰之功效,可生髓益腎強(qiáng)骨,固經(jīng)止血,補(bǔ)心安神,其主要含有蛋白、氨基酸等成分。醋龜甲散劑可顯著提高骨質(zhì)疏松小鼠股骨的鈣、磷含量,灰質(zhì)量,灰質(zhì)量/去脂干質(zhì)量[1];龜板可顯著提高激素性骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度、骨小梁厚度、骨礦物質(zhì)含量、骨表面積等[2],龜甲膠可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖,抑制其凋亡[3],并可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖并分化為成骨細(xì)胞[4-5]。成骨細(xì)胞活性失衡導(dǎo)致的骨量減少可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[6],MC3T3-E1細(xì)胞系是從新生的C57BL/6小鼠頗頂骨中分離培養(yǎng)的成骨細(xì)胞系,其具有堿性磷酸酶活性、膠原合成及基質(zhì)礦化等成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性,并能夠表達(dá)一定水平的成骨分化相關(guān)基因和蛋白。該細(xì)胞系是體外研究成骨細(xì)胞分化的良好模型,也是研究藥物對(duì)成骨細(xì)胞活性影響的理想細(xì)胞模型[7-8]。

閃式提取(Flash extraction,FE)技術(shù)可以使藥材細(xì)胞組織在高速的剪切作用下快速破碎[9-10],利于蛋白的溶出,能有效保留提取物活性成分[11];超聲提取(Ultrasound extraction,UE)技術(shù)對(duì)于天然物質(zhì)的提取速度快[12],蛋白的溶出效率提高,已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物源蛋白質(zhì)和多肽的提取[13-14];磁力攪拌提取(Magnetic stirring extraction,MSE)不產(chǎn)生高溫,且操作以及設(shè)備的要求較簡單,是值得推廣的輔助提取方式[15]。超濾技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[16],可用于蛋白質(zhì)的脫醇、脫鹽、濃縮與分級(jí)分離[17-18]。超濾是利用膜兩側(cè)壓力動(dòng)力,機(jī)械篩分的分離過程[19-20],操作簡便,成本低[21],生物大分子不會(huì)因溫度、pH改變被破壞[22]。待超濾樣品溶液在蠕動(dòng)泵的壓力下流入超濾器中,分子量小于膜孔的成分成為透過液,大于膜孔的成分被截留[23],達(dá)到將樣品溶液按分子量分離的目的。

動(dòng)物類中藥含有的主要成分是蛋白質(zhì)、肽類物質(zhì),且其具有較好的活性[24-25],因此蛋白成分的提取方法逐漸被重視,吳慶等[26]通過研究不同提取方法對(duì)地龍蛋白的比較,確定了地龍蛋白的最佳提取方法,公維潔等[27]應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化了馬面魚皮膠原蛋白的超聲輔助提取工藝,樊曉盼等[28]應(yīng)用響應(yīng)面法研究熱壓浸提牛骨蛋白提取工藝,但目前關(guān)于龜甲蛋白質(zhì)的提取工藝鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖作用為指標(biāo)篩選龜甲中蛋白類物質(zhì)提取方法,并采用響應(yīng)面法(Box-Behnken Design,BBD)對(duì)龜甲蛋白提取方法進(jìn)行優(yōu)化,進(jìn)一步將龜甲蛋白提取物經(jīng)過超濾技術(shù),選用1、3、10 kDa超濾膜按分子質(zhì)量分為不同組分,篩選龜甲促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的活性組分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龜甲(Tortoise shell,TS) 吉林省長春市百草大藥房;小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心;考馬斯亮藍(lán) 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;牛血清白蛋白 上海源葉生物科技有限公司;a-MEMHyClone、新生胎牛血清 美國Gibco公司;Cell Counting Kit-8CCK8 北京博奧森;其他試劑 均為分析純。

CKX41倒置顯微鏡 日本奧林巴斯公司;BT125D十萬分之一電子天平 德國Sartorius;JHBE-50S閃式提取器 西安太康生物科技有限公司;KS-250DE超聲波清洗器 潔力美超聲儀器有限公司;DF101-S磁力加熱攪拌器 金壇市水北康輝實(shí)驗(yàn)儀器廠;Alpha 1-2 LDplus冷凍干燥機(jī) 德國Christ;SPEPORD? 200紫外可見分光光度計(jì) 德國耶拿分析儀器股份公司;MASTERFLEX?I/P?超濾系統(tǒng),1、3、10 kDa超濾膜包 Millipore。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 龜甲前處理 將TS砸成小塊后粉碎過3號(hào)篩,置于密封袋內(nèi)保存。

1.2.2 龜甲中蛋白類物質(zhì)提取方法的篩選 探討提取方法對(duì)龜甲中蛋白類物質(zhì)的蛋白含量及其成骨活性的影響。

1.2.2.1 超聲提取 準(zhǔn)確稱取1.2.1中龜甲粉末置于錐形瓶內(nèi),按1∶10倍量加入蒸餾水,在20 ℃下超聲2 h,提取液于3600 r/min離心20 min,取上清液過濾,凍干,得到龜甲蛋白凍干粉(UEP)。

1.2.2.2 閃式提取 準(zhǔn)確稱取1.2.1中龜甲粉末置于錐形瓶內(nèi),按1∶10倍量加入蒸餾水,在20 ℃條件下采用閃式提取器提取2 min,提取液于3600 r/min離心20 min,取上清液過濾,凍干,得到龜甲蛋白凍干粉(FEP)。

1.2.2.3 磁力攪拌提取 準(zhǔn)確稱取1.2.1中龜甲粉末置于圓底燒瓶內(nèi),按1∶10倍量加入蒸餾水,在20 ℃條件下置恒溫水浴磁力攪拌下提取2 h,提取液于3600 r/min離心20 min,取上清液過濾,凍干,得到龜甲蛋白凍干粉(MSEP)。

1.2.3 龜甲蛋白含量測定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 考馬斯亮藍(lán)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)(G-250)溶于50 mL 95%乙醇溶液中,加入100 mL 85%磷酸溶液混合搖勻,用蒸餾水補(bǔ)充至1000 mL,混勻,過濾,備用。分別精密量取牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/mL)0、100、200、300、400、500 μL置于試管中,用蒸餾水補(bǔ)足至1 mL,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液,混勻,室溫靜置5 min。以加入0 μL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液管為參比,于測定595 nm處吸光度A值。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量濃度(μg/mL)作為橫坐標(biāo)(x),將A595 nm作為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 樣品溶液蛋白含量的測定 分別稱取龜甲蛋白凍干粉UEP、FEP、MSEP,配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL樣品溶液,1 mL樣品溶液加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液,混勻,室溫反應(yīng)5 min,測定595 nm處A值,根據(jù)1.2.3.1得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蛋白含量,計(jì)算公式如下。

式中:c為供試品(樣液)溶液中的蛋白質(zhì)濃度(μg/mL);V為供試品(樣液)體積；D為樣品溶液的稀釋倍數(shù);W樣為樣品質(zhì)量(μg)。

1.2.4 對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖率的影響

1.2.4.1 MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng) 將凍存的MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)蘇后,用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),當(dāng)MC3T3-E1細(xì)胞貼壁時(shí),吸去培養(yǎng)液,用PBS洗3次至無漂浮細(xì)胞,加入含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶80%～90%時(shí),進(jìn)行傳代培養(yǎng),隔2～3 d傳代一次,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.2 CCK8檢測細(xì)胞增殖活性 以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的樣品,使各組的終濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg/mL,每組5個(gè)復(fù)孔,空白對(duì)照組(Control)不加藥只加含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液,于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL CCK8試劑,37 ℃避光孵育2 h,在酶標(biāo)儀上450 nm檢測各組OD值。根據(jù)所測得吸光度,計(jì)算每組細(xì)胞增殖率,計(jì)算公式如下。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化龜甲水溶性蛋白的蛋白含量提取工藝

1.2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn) 采用磁力攪拌方法,分別考察提取時(shí)間、溫度、液料比3個(gè)因素對(duì)龜甲蛋白含量的影響。提取時(shí)間,固定溫度及料液比:20 ℃、1∶12 (g/mL),時(shí)間設(shè)定為1、2、3、4、5 h;提取溫度,固定提取時(shí)間及料液比:3 h、1∶12 (g/mL),溫度設(shè)定為20、25、30、35、40 ℃;料液比,固定提取溫度及時(shí)間:20 ℃、3 h,料液比設(shè)定為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18 (g/mL)。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。

1.2.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以蛋白含量為響應(yīng)指標(biāo),選擇提取時(shí)間、溫度、液料比3個(gè)因素為優(yōu)化對(duì)象,進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)-BBD分析,得到龜甲蛋白提取的適宜工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)因素水平如表1所示,Design-Expert 10.0.4軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factor and level of response surface experiment

1.2.6 超濾膜分級(jí)不同分子量 依次使用截留分子量為10、3和1 kDa的超濾膜包對(duì)龜甲蛋白溶液進(jìn)行超濾分離。分別收集不同相對(duì)分子質(zhì)量范圍的天然蛋白溶液,凍干,以對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性影響篩選活性組分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次平行試驗(yàn)的平均值,采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示,組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量濃度(μg/mL)作為橫坐標(biāo)(x),將A595 nm作為縱坐標(biāo)(y),繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1,得線性回歸方程:y=0.0066x+0.0016,R2=0.9991,表明在質(zhì)量濃度為0～50 μg/mL范圍內(nèi)時(shí),BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of BSA

2.2 不同提取方法對(duì)TS蛋白提取的影響

2.2.1 不同提取方法對(duì)TS蛋白含量的影響 UE、FE、MSE 3種方法提取的TS蛋白含量如圖2所示,采用不同提取方法得到的龜甲蛋白量的差異性大,其中MSEP的龜甲蛋白含量最大8.86%,就蛋白含量而言,3種提取方法得到的蛋白含量順序?yàn)?MSE>FE>UE。

圖2 不同提取方法對(duì)TS蛋白含量的影響Fig.2 Effect of methods on the extraction content of protein注:不同方法之間的顯著差異 由不同的小寫字母表示(P<0.05)。

2.2.2 不同提取方法對(duì)TS蛋白活性的影響 由圖3可知,經(jīng)3種方法不同濃度的龜甲蛋白干預(yù)后MC3T3-E1細(xì)胞的增殖率均較空白對(duì)照組升高,且呈濃度依賴性,閃提方法得到的蛋白提取物在質(zhì)量濃度25～200 μg/mL范圍內(nèi)與空白對(duì)照組間細(xì)胞增殖率有顯著性差異(P<0.05),增殖率為7.39%～11.20%;超聲方法得到的蛋白提取物在質(zhì)量濃度12.5～100 μg/mL范圍內(nèi)與空白對(duì)照組間的細(xì)胞增殖率差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且對(duì)細(xì)胞的增殖率為9.39%～14.26%,質(zhì)量濃度200 μg/mL時(shí)增殖率極顯著升高(P<0.01),此時(shí)細(xì)胞增殖率達(dá)至17.74%;與空白對(duì)照組相比,磁力攪拌方法得到的蛋白提取物在質(zhì)量濃度12.5～50 μg/mL范圍內(nèi)MC3T3-E1細(xì)胞增殖率顯著升高(P<0.05),增殖率分別為11.35%、13.47%、14.04%,質(zhì)量濃度100、200 μg/mL時(shí)增殖率極顯著升高(P<0.01)，為18.93%、23.46%,在質(zhì)量濃度100、200 μg/mL時(shí),磁力攪拌得到的蛋白對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖率顯著(P<0.05)高于超聲,其比超聲增加32.75%、32.24%。就蛋白活性而言,3種提取方法得到的蛋白活性順序?yàn)?(質(zhì)量濃度為200 μg/mL)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明磁力攪拌方法得到的龜甲蛋白含量最高，活性最好，故進(jìn)一步對(duì)磁力攪拌提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

圖3 不同提取方法對(duì)TS蛋白活性的影響Fig.3 Effect of methods on the extraction activity of protein(x±s,n=3)注:#表示與空白對(duì)照組相比，數(shù)據(jù)差異顯著,P<0.05, ##表示數(shù)據(jù)差異極顯著，P<0.01；Δ表示與超聲相比， 磁力攪拌得到樣品數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 不同提取時(shí)間對(duì)TS蛋白提取的影響 由圖4可知,在提取時(shí)間1～3 h范圍內(nèi),隨著時(shí)間的延長,TS蛋白含量隨之增加,推測是由于起初蛋白還未充分溶解于水中,導(dǎo)致溶液中蛋白含量較低[29],隨著提取時(shí)間的延長,蛋白質(zhì)分子更多的親水基團(tuán)暴露[30],使其溶解度增大,從而提高了溶液中的蛋白含量。當(dāng)提取時(shí)間3 h時(shí),蛋白含量達(dá)到最高值8.16%(P<0.05);3 h后,TS蛋白含量隨時(shí)間的增加而下降,可能提取時(shí)間過長,溶液中蛋白質(zhì)分子間相互作用增強(qiáng)而形成聚集、沉淀,溶解在提取液中的蛋白質(zhì)含量減少[31-32],3與4 h無顯著現(xiàn)差異,為了節(jié)約時(shí)間,選擇反應(yīng)時(shí)間3 h用于響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖4 提取時(shí)間對(duì)蛋白含量的影響Fig.4 Effect of time on the extraction content of protein注:不同數(shù)據(jù)的顯著差異由不同的 小寫字母表示(P<0.05);圖5～圖6同。

2.3.2 不同提取溫度對(duì)TS蛋白提取的影響 由圖5可知,隨著提取溫度的升高,蛋白含量增加,可能是由于溫度升高使水溶性蛋白質(zhì)與水分子相互作用增強(qiáng),進(jìn)而蛋白質(zhì)的溶解度增加、含量升高[33]。當(dāng)提取溫度為30 ℃時(shí)蛋白含量為最高8.49%,發(fā)現(xiàn)其蛋白含量顯著高于其他樣品組(P<0.05),溫度高于30 ℃時(shí),可能隨著提取溫度進(jìn)一步升高,蛋白的結(jié)構(gòu)展開,導(dǎo)致其疏水性增加,引起蛋白交聯(lián)聚集,溶解度降低[34]。

圖5 提取溫度對(duì)蛋白含量的影響Fig.5 Effect of temperature on the extraction content of protein

2.3.3 不同料液比對(duì)TS蛋白提取的影響 由圖6可知,TS蛋白含量受料液比影響顯著。料液比在1∶10～1∶12 (g/mL)范圍內(nèi),料液比的增加使溶質(zhì)體系分布得更加均勻,蛋白的溶出量上升[35],當(dāng)料液比為1∶12 (g/mL)時(shí)蛋白含量達(dá)到最大10.65%,相比于其他料液比有顯著性差異(P<0.05),可溶性蛋白的溶解度達(dá)到飽和,當(dāng)超過1∶12 (g/mL)時(shí),蛋白含量隨著料液比的增加而下降,由于液料比過大使提取液濃度過低,提取液中蛋白質(zhì)濃度降低[36],同時(shí)過多的溶劑使樣品在溶液中過于分散[37],不利于蛋白成分的溶出。因此,選擇料液比用于1∶12 (g/mL)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖6 料液比對(duì)蛋白含量的影響Fig.6 Effect of solid-liquid radio on the extraction content of protein

2.2.1～2.2.3中在相同條件下:料液比1∶12,3 h,20 ℃,蛋白含量分別為7.94%、6.52%、10.65%,具有一定的實(shí)驗(yàn)誤差,可能是由于實(shí)驗(yàn)不在同一天進(jìn)行,龜甲樣品處理后,未及時(shí)測定,其中的蛋白成分在室溫條件下不穩(wěn)定發(fā)生了降解,故使蛋白含量產(chǎn)生了差異性,后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)避免此類問題。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面模型的建立與分析 根據(jù)2.3單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,通過Design-Expert 10.0.4軟件,以TS蛋白含量(Y)為指標(biāo),對(duì)料液比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C),進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)-BBD,共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experiment design and results

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析Table 3 Significant test and variance analysis for the regression model

運(yùn)用Design-Expert 10.0.4軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,以TS蛋白含量(Y)為響應(yīng)值的回歸方程:Y=15.11+1.24A+0.79B+0.59C-0.51AB+0.65AC-0.69BC-2.13A2-3.41B2-4.09C2,方差分析結(jié)果見表3。

圖7 料液比與提取溫度交互作用Fig.7 Interactive effect between solid-liquid radio and extraction temperature

圖8 料液比與提取時(shí)間交互作用Fig.8 Interactive effect between solid-liquid radio and extraction time

圖9 提取溫度與提取時(shí)間交互作用Fig.9 Interactive effect between extraction temperature and extraction time

2.4.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化 利用Design-Expert 10.0.4軟件做不同因素間響應(yīng)面分析圖及等高線圖,響應(yīng)面圖和等高線圖可反映各因素間的相互作用及最佳參數(shù)[40]。

圖7a坡度陡峭說明料液比與提取溫度對(duì)蛋白含量有顯著影響,但二者間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著;由圖8a可知,蛋白含量隨料液比及提取時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,二者的陡峭程度說明均對(duì)蛋白含量有顯著影響,圖8b等高線呈橢圓形且曲線較密集,說明料液比與提取時(shí)間兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著,如圖9a所示隨著提取溫度及時(shí)間的升高,蛋白含量先升高后降低,圖9b等高線較密集但呈近圓形,說明提取溫度與提取時(shí)間兩因素之間交互作用不明顯,這與方差分析結(jié)果一致。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過軟件Design-Expert 10.0.4求解方程,計(jì)算得到蛋白得率達(dá)到最大值時(shí)的最優(yōu)提取工藝條件為:料液比1∶12.88 (g/mL),溫度30.58 ℃,時(shí)間3.08 h,蛋白含量預(yù)測值15.35%。結(jié)合實(shí)際條件,對(duì)該條件進(jìn)行修正:料液比1∶13 (g/mL),提取溫度30 ℃,提取時(shí)間3 h。該條件下進(jìn)行三次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),取平均值,得龜甲蛋白含量為15.16%,與預(yù)測值相接近,為龜甲蛋白的提取提供了良好的技術(shù)支撐。

2.5 不同分子質(zhì)量的TS對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性結(jié)果

TS不同組分對(duì)MC3TC-E1細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見圖10。由圖10可知，與空白對(duì)照組比較,TS組分1在質(zhì)量濃度為12.5～100 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖率顯著升高(P<0.05),質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖率極顯著升高(P<0.01);與空白對(duì)照組比較,組分2在質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖率有顯著差異性(P<0.05),質(zhì)量濃度為25～200 μg/mL時(shí)極顯著升高(P<0.01);組分3與空白對(duì)照組比較在質(zhì)量濃度為12.5～50 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),質(zhì)量濃度為100、200 μg/mL時(shí)高度顯著(P<0.001);與空白對(duì)照組比較,組分4在質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖率顯著升高(P<0.05),質(zhì)量濃度為25～100 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖率極顯著升高(P<0.01),質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖率高度顯著(P<0.001),;組分5與空白對(duì)照組比較,在質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖率差異明顯(P<0.05),對(duì)細(xì)胞的增殖率為10.24%,質(zhì)量濃度為25～50 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖率極顯著升高(P<0.01),此時(shí)的細(xì)胞增殖率是19.65%、30.71%,質(zhì)量濃度為100、200 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖率差異高度顯著(P<0.001),增殖率至35.24%、38.15%,結(jié)果表明TS不同組分均能促進(jìn)MC3T3-E1前成骨樣細(xì)胞增殖,并呈劑量依賴效應(yīng),結(jié)果見圖10。

圖10 TS不同組分對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞增殖影響(x±s,n=3)Fig.10 Effects of different components of TS on the proliferation of MC3T3-E1 cells(x±s,n=3)注:通過超濾技術(shù)將龜甲提取液分為總提組分(組分1),Mw>10 kDa(組分2),Mw:3～10 kDa(組分3),Mw:1～3 kDa(組分4),Mw<1 kDa(組分5)；#表示與空白對(duì)照組相比差異顯著，P<0.05,##表示差異極顯著；###表示差異高度顯著。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，TS不同組分對(duì)MC3T3-E1增殖程度順序?yàn)?組分5>組分4>組分3>組分2>組分1,即組分5(<1 kDa組分)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖效果最佳。

3 討論與結(jié)論

龜甲滋陰補(bǔ)腎,強(qiáng)腎健骨,可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化[41],并對(duì)骨質(zhì)疏松有較好的治療效果[42],本文以蛋白含量及對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性影響為指標(biāo)篩選龜甲蛋白的提取方法,研究表明磁力攪拌得到的蛋白含量得率高,且促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖作用最強(qiáng),進(jìn)而以單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ),采用響應(yīng)面分析法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化,增加龜甲水溶性的蛋白含量,得到最佳提取工藝為:料液比1∶13 (g/mL),提取溫度30 ℃,提取時(shí)間3 h,在此條件下龜甲蛋白含量為15.16%,為提高龜甲利用率提供依據(jù)。

張玉卓等[43]探討了龜甲水提取液對(duì)MC3T3-E1的增殖活性影響,其中在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí),細(xì)胞增殖率為13.93%,本實(shí)驗(yàn)中相同濃度下的龜甲水提取液對(duì)成骨細(xì)胞的增殖活性為20.58%,相較而言增殖率略大,可能是龜甲的提取方法不同,且對(duì)細(xì)胞增殖活性的檢測方法也不同,上述報(bào)道研究的龜甲水提取液是對(duì)分化成骨細(xì)胞的增殖作用,本文探討的是對(duì)未加分化誘導(dǎo)劑MC3T3-E1的增殖作用影響。

超濾技術(shù)可以將蛋白提取液按不同分子量分離,選擇的超濾膜規(guī)格越小,得到超濾液分子量越小越穩(wěn)定,溶液中的蛋白質(zhì)以穩(wěn)定的方式存在[44]。楊康[45]將牦牛血超濾分級(jí)得到的低于1 kDa低聚肽與商品化大豆低聚肽的體外抗氧化能力進(jìn)行比較,前者優(yōu)于后者;張建友等[46]分析得到醬油中分子質(zhì)量小于2 ku的肽段抗氧化能力較強(qiáng);陳發(fā)河等[47]發(fā)現(xiàn)海地瓜小于1 ku的肽類成分相較于大分子量的蛋白、肽類成分表現(xiàn)出更強(qiáng)的·OH的清除能力,青維等[48]研究不同分子量的大鯢肽抗氧化活性,結(jié)果表明小分子量的0.3～2 ku的大鯢肽抗氧化活性最高。本文采用膜過濾手段對(duì)龜甲蛋白分離為5個(gè)不同組分:總提組分、Mw>10 kDa組分、Mw:3～10 kDa組分、Mw:1～3 kDa組分、Mw<1 kDa組分,不同組分在質(zhì)量濃度為12.5～200 μg/mL范圍內(nèi),對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞均有一定的增殖能力,且活性隨著濃度的升高而升高,有劑量依賴性,分子量低于1 kDa的組分活性最佳,其中主要成分為寡肽,故Mw<1 kDa寡肽組分的龜甲促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖活性最佳,這與上述文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致,分子量小的肽類化合物活性優(yōu)于分子量大的蛋白肽類化合物。