劉華文,蘇海雁,陸小康,薛亞馨,呂 敏,張榮林,莫 迎

(廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測中心,廣西南寧 530021)

全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展迅猛,人們生活水平提高,食品安全也越來越得到人們的重視?，F(xiàn)今農(nóng)藥在水果蔬菜以及茶葉等農(nóng)產(chǎn)品上應(yīng)用十分廣泛,導(dǎo)致農(nóng)藥殘留量大大增加,如果人們過量攝入殘余農(nóng)藥則會產(chǎn)生毒副作用[1]危及身體健康,因此提高農(nóng)殘檢測技術(shù)以解決食品安全問題日趨重要[2-5]。近年來,國家不斷完善食品標(biāo)準(zhǔn),制定嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[6]。茶葉作為我國傳統(tǒng)飲品,深得人們喜愛,具有延緩衰老、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗動脈硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗腫瘤作用[7-9]。茶葉需求量和種植面積與日增多,但由于病蟲害影響茶葉的產(chǎn)量與質(zhì)量,人們?yōu)榉老x使用農(nóng)藥也越來越廣,如有觸殺毒性的樂果、具有胃毒作用的擬除蟲酯類、強(qiáng)殺卵作用的殺螨劑、強(qiáng)滲透作用或腐蝕力的馬拉硫磷、殺菌劑多菌靈等,導(dǎo)致茶葉農(nóng)藥殘留超出限量范圍,從而制約我國茶葉的發(fā)展[10-13]。茶葉中含有茶多酚、咖啡堿、色素等多種物質(zhì),基質(zhì)復(fù)雜,且茶葉炒制工藝繁瑣,水分大量丟失,茶葉農(nóng)藥殘留的檢測一直備受關(guān)注。當(dāng)前,固相萃取法[14]、固相微萃取法[15]、液-液萃取法[16]、加速溶劑萃取法[17]、基質(zhì)固相分散法[18]等是檢測茶葉中農(nóng)藥殘留的常用前處理方法,以上方法局限性在于操作方法繁瑣以及試劑消耗量較大。

茶葉成分復(fù)雜,農(nóng)藥殘留分析時(shí)干擾嚴(yán)重。因此,茶葉需要更具針對性的、抗干擾性更強(qiáng)、更準(zhǔn)確快速的農(nóng)藥殘留檢測方法。QuEChERS是美國Anastassiades教授在農(nóng)產(chǎn)品檢測方面提出的一種快速樣品前處理技術(shù)[19],具有經(jīng)濟(jì)環(huán)保、操作簡便、適用范圍廣[20-22]等特點(diǎn)。付曉芳等[23]使用QuEChERS法研究了茶葉中氟蟲腈殘留量的檢測方法。本研究利用QuEChERS方法,根據(jù)近年國家監(jiān)督抽檢茶葉項(xiàng)目和檢出數(shù)據(jù),結(jié)合GB 2763 - 2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》新增的項(xiàng)目,選取茶葉中28種代表性農(nóng)藥,運(yùn)用QuEChERS法進(jìn)行前處理,結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測茶葉中農(nóng)藥的殘留,可用于實(shí)驗(yàn)室日常檢驗(yàn),同時(shí)把該方法用于Fapas能力驗(yàn)證,選取28種農(nóng)藥作為研究對象。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉 Fapas能力驗(yàn)證提供的綠茶,分別為空白茶葉和待測茶葉;28種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr. Ehrensterfer DmbH公司;乙腈、丙酮、乙酸、甲酸色譜純 德國Merck公司;無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、無水醋酸鈉、乙酸銨分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18) 天津博納艾杰爾科技有限公司;實(shí)驗(yàn)用水 超純水。

1290超高效液相色譜儀 美國Agilent公司;API 6500三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配制AB SCIEX數(shù)據(jù)處理軟件、電噴霧源 美國AB SCIEX公司;MS303TS型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)公司;Multi Reax渦旋儀 德國Heidolph;Shaker SA320振蕩器 日本YAMATO公司;X3R高速冷凍離心機(jī) 美國熱電Thermo公司;

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

樣品的前處理:提取:稱取粉碎后的茶葉樣品2 g(精確至0.01 g)于50 mL聚丙烯具塞離心管中,分別加入10 mL水和15 mL 1%乙酸乙腈,渦旋混勻2 min,再加入QuEChERS鹽析劑(1.5 g乙酸鈉,6 g無水硫酸鎂),立即搖勻,置于振蕩器上劇烈振蕩3 min(450次/min),置于冰浴中冷卻5 min,以10000 r/min離心5 min,上清液待凈化。

凈化:取上清液1.5 mL置于已預(yù)先裝有150 mg無水硫酸鈉、50 mg C18、50 mg PSA凈化材料的15 mL離心管中,渦旋30 s使其充分混勻,再置振蕩器上激烈振蕩5 min(450次/min)使其凈化完全,以10000 r/min離心5 min,濾過(0.22 μm有機(jī)濾膜),待檢測。

1.3 色譜條件

色譜柱:Capcell PakBB-H C18液相色譜柱(3.0 μm,2.1 mm×150 mm,日本SHISEIDO公司);流動相:A為5 mmol/L乙酸銨(含0.05%甲酸),B為甲醇(含0.05%甲酸)。梯度洗脫程序:0～2.0 min,90% A;2.0～10.0 min,90%～60% A;10.0～20.0 min,60%～5% A;20.0～25.0 min,5% A;25.0～25.1 min,5%～90% A;25.1～30.0 min,90% A;流速:0.30 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:5.0 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描模式;檢測方式:多反應(yīng)檢測模式;電噴霧電壓:5500 V;霧化氣(氮?dú)?壓力:50.0 psi;輔助氣壓力:60.0 psi;氣簾氣(氮?dú)?壓力:20.0 psi;碰撞氣(氮?dú)?壓力:7.0 psi;離子源溫度:550 ℃;掃描時(shí)間:60 ms;碰撞室入口電壓:7 V;碰撞室出口電壓:12 V;各目標(biāo)化合物的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

1.5 基質(zhì)匹配工作曲線的配制和繪制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:分別準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用乙腈或丙酮配制成1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,-20 ℃保存。分別移取一定體積的各標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL棕色容量中,用乙腈定容至刻度,得到1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取空白基質(zhì)樣品,按“1.2”處理后,適量加入上述配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,定容至1.0 mL,渦旋混勻,濾過(0.22 μm有機(jī)濾膜),上機(jī)測定,繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.6 數(shù)據(jù)處理

分別利用Analyst Software和MutiQuant 3.0.2軟件(AB SCIEX)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及處理,Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總和分析。

表1 28種農(nóng)藥的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 MS acquisition parameters of 28 kinds of pesticides

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別配制0.1 μg/mL的各化合物標(biāo)準(zhǔn)品,使用電噴霧質(zhì)譜用蠕動泵持續(xù)進(jìn)樣,與適當(dāng)流速的流動相混合后注入質(zhì)譜,優(yōu)化噴霧電壓、噴霧器溫度等質(zhì)譜參數(shù),由于大部分化合物結(jié)構(gòu)中含有N、P和鹵代烴,易形成[M+H]+、[M+Na]+等加合離子,適用于ESI+掃描模式,且響應(yīng)強(qiáng)度較好。調(diào)整噴針的電壓,降低基質(zhì)等雜質(zhì)帶來的干擾。優(yōu)化錐孔電壓使母離子響應(yīng)豐度最大且穩(wěn)定,同時(shí)優(yōu)化碰撞能量,選取響應(yīng)豐度較高、易得到、出峰穩(wěn)定的碎片離子作為子離子,再通過配制茶葉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,排除易受基質(zhì)干擾的碎片,確定定性離子對及定量離子對,具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2 色譜條件優(yōu)化

在優(yōu)化的質(zhì)譜條件下,考察不同色譜柱和不同流動相對目標(biāo)物質(zhì)譜信號的影響。本實(shí)驗(yàn)對比了3種色譜柱,Waters Atlantis T3色譜柱(3.0 μm,2.1 mm×150 mm),SHISEIDOCapcell Pak BB-H C18色譜柱(3.0 μm,2.1 mm×150 mm),大曹三耀Capcell Core C18色譜柱(2.7 μm,2.1 mm×150 mm)。分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇(0.05%甲酸)-5 mmol/L乙酸銨溶液(0.05% 甲酸)、乙腈(0.05%甲酸)-5 mmol/L乙酸銨溶液(0.05% 甲酸)幾種流動相對目標(biāo)化合物的影響。結(jié)果顯示使用SHISEIDO BB-H C18色譜柱和甲醇(0.05%甲酸)-水(5 mmol/L乙酸銨0.05%甲酸)體系,適用性更好。甲醇較乙腈在離子響應(yīng)及分離度上更好,而加入了甲酸可以明顯提高28種農(nóng)藥殘留的離子化效率,乙酸銨能有效解決峰拖尾和提高信號響應(yīng)。在梯度洗脫條件下農(nóng)藥出峰均勻,峰形尖銳,分離度好,保留時(shí)間適中。28種農(nóng)藥的總離子流圖見圖1。

圖1 28 種農(nóng)藥的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram(TIC)of 28 pesticide residues

2.3 提取條件的優(yōu)化

在貯藏運(yùn)輸過程中,要保持茶葉含水量低于10%,才能避免茶葉處于活躍狀態(tài),產(chǎn)生霉變[24]。目前,在茶葉農(nóng)殘檢測中,對提取方法中是否加水存在較多的爭議。有研究表明[25],茶葉加水提取的上層清液顏色明顯比不加水提取的顏色深,加水提取后大量色素類物質(zhì)溶出,其基質(zhì)影響明顯高于不加水提取,不利于后續(xù)的凈化過程,造成提取回收率較差。但在歐盟EN15662-2008[26]中提到使用QuEChERS方法,當(dāng)樣品含水量<80%時(shí),需要提前補(bǔ)水至100%。本實(shí)驗(yàn)對比了加水與不加水兩種條件對于茶葉中農(nóng)藥提取的影響。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也比較了乙腈、丙酮、乙酸乙酯及1%乙酸乙腈作為提取溶劑時(shí),對茶葉中農(nóng)藥的提取效果。結(jié)果顯示,加水后1%乙酸乙腈作為提取溶劑,對各農(nóng)藥均有較好的提取效果,對茶葉基質(zhì)有較強(qiáng)的滲透作用,加水后噠螨靈、滅多威等農(nóng)藥提取效率明顯高于不加水的提取過程,同時(shí)加入1%乙酸酸化,避免堿性或中性環(huán)境下不穩(wěn)定的農(nóng)藥的降解和損失。加水浸泡的時(shí)間越長,提取的共萃物就越多。LC-MS/MS在m/z 50～2000范圍內(nèi)全掃描得到的總離子圖顯示,提取液的共萃物更少(圖2)。因此,本實(shí)驗(yàn)采取加水提取,1%乙酸乙腈作為提取溶劑提取茶葉中的農(nóng)藥。

2.4 凈化條件

圖2 丙酮(A)、乙酸乙酯(B)、1%乙酸乙腈(C)、乙腈(D)作為提取溶劑的總離子流圖Fig.2 TIC of the acetone(A),ethyl acetate(B),1% glacial acetic acid acetonitrile(C)and acetonitrile(D)as solvents for extraction

樣品茶葉含有多種色素,經(jīng)過有機(jī)溶劑提取后,樣液呈墨綠色,共萃雜質(zhì)多,直接進(jìn)儀器分析,既污染分析柱和離子源,又影響儀器的響應(yīng)。目前凈化基質(zhì)常用的吸附劑有PSA、C18、GCB和MWCNTs。PSA的表面鍵合極性官能團(tuán),具有極性吸附作用和弱陰子交換功能[27],能有效去除樣品基質(zhì)中的有機(jī)酸、色素和糖類雜質(zhì)；GCB具有片狀結(jié)構(gòu),是一種非極性吸附劑,主要用于去除樣品中的色素、甾醇和維生素,對含苯環(huán)官能團(tuán)的化合物有較強(qiáng)的吸附作用；C18的有效成分是硅膠鍵合的十八烷基,具有疏水性,主要是去除脂肪和非極性物質(zhì)；MWCNTs比表面積大,吸附能力強(qiáng),能有效的吸附色素和雜質(zhì)。但是各種凈化劑在去除雜質(zhì)的同時(shí)也會吸附目標(biāo)化合物。研究中加入150 mg無水硫酸鎂,旨在去除提取液中的水,保證其他凈化填料的吸附效果。由于GCB和MWCNTs能夠強(qiáng)烈吸附各種化合物,同時(shí)無選擇性的對非極性農(nóng)藥也有吸附作用,降低大部分農(nóng)藥的回收率。因此,本實(shí)驗(yàn)選取PSA、C18作為凈化填料,比較了不同配比PSA、C18的凈化效果。取1.5 mL提取液,固定加入10 mg PSA,分別考察C18添加量為10、20、40、50、60、80 mg的回收率,在C18添加量為50 mg時(shí),各農(nóng)藥的回收率最佳;固定C18用量,比較PSA添加量10、20、40、50、60、80 mg的回收率,在PSA添加量為50 mg時(shí),各農(nóng)藥的回收率達(dá)到最佳,最終凈化配比確定為C1850 mg、PSA 50 mg,在此凈化配比下,添加10、50、80 ng/mL濃度水平的28 種目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收率(圖3)。

圖3 28種農(nóng)藥的回收率Fig.3 Recoveries of 28 pesticides

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect)是指樣品中的其他成分對目標(biāo)分析物離子響應(yīng)強(qiáng)度的影響,即基質(zhì)對分析方法準(zhǔn)確性的干擾。LC-MS/MS 的基質(zhì)效應(yīng)由分析物的共流出組分影響電噴霧離子源的離子化效率所致,也被認(rèn)為是誤差的重要來源,常會導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高或偏低,ESI容易受樣品基質(zhì)的影響,一般使用正離子模式進(jìn)行檢測時(shí),會產(chǎn)生較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)可采用以下公式進(jìn)行計(jì)算:

式中:ME為基質(zhì)效應(yīng);A為溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;B為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

若ME<1,則表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng),ME>1,則為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)對28種化合物的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了評估(見圖4),發(fā)現(xiàn)吡蟲啉、稻豐散、啶蟲脒、毒死蜱、二唑磷、甲基嘧啶磷、喹螨醚、樂果、綠谷隆、馬拉硫磷、嘧霉胺、肟菌脂、乙硫磷、唑蟲酰胺、喹硫磷等基質(zhì)抑制效應(yīng)不明顯;化合物噠螨靈、甲萘威、滅多威、炔螨特、噻嗪酮機(jī)制抑制效應(yīng)較為明顯;化合物毒蟲畏、呋蟲胺、溴氰菊酯存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),而以多菌靈、久效磷、三唑磷、特丁津、沙螟硫磷最為明顯。因此,本方法采用配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的方法消除基質(zhì)影響,能夠滿足農(nóng)藥殘留的檢測要求。

圖4 28種農(nóng)藥在茶葉中的基質(zhì)效應(yīng)Fig.4 Matrix effects of 28 pesticides in tea

2.6 線性范圍、檢出限與定量限

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,按“1.5”方法配制6個(gè)濃度水平的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,上機(jī)測定,以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。28種目標(biāo)化合物在各自范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)(r)為0.990～0.998。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測定,以定量離子信噪比S/N≥3得到28種目標(biāo)化合物的檢出限(LOD)為0.08～1.26 μg/kg,以S/N≥10得到定量限(LOQ)為0.28～4.20 μg/kg(見表2),滿足農(nóng)藥殘留的檢測要求。

表2 28種待測物的基質(zhì)效應(yīng)、檢出限、定量限、線性范圍、平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Matrix effects,LOD,LOQ,linear ranges,average recoveries and relative standard deviations of 28 analytes(n=6)

2.7 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

向空白基質(zhì)樣品中添加3個(gè)濃度水平(10、50、80 μg/kg)的28種目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“1.2”方法進(jìn)行前處理后上機(jī)測定,每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行試驗(yàn)。計(jì)算得到28種待測物的平均回收率均在72.5%～118.5%范圍內(nèi),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.8%～16.3%(見表2)。

2.8 本法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法的比較

以綠茶為例,參照國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 23200.13 -2016[28]農(nóng)藥的回收率作為理論數(shù)值,考察本法的回收率,結(jié)果列于表3。結(jié)果表明,QuEChERS方法的回收率在72.5%～118.5%之間,國家標(biāo)準(zhǔn)方法的回收率在64.2%～114.8%之間。國家標(biāo)準(zhǔn)方法中嘧霉胺回收率為(0.0%～0.0%),可能加入1 LOQ濃度水平,儀器的靈敏度不高,致使無法檢測;炔螨特的回收率為(107.6%～141.7%),可能為基質(zhì)效應(yīng)影響。QuEChERS方法的回收率較國家標(biāo)準(zhǔn)方法的回收率有明顯提升,同時(shí)省略過柱的步驟,減少有機(jī)試劑的使用和實(shí)驗(yàn)時(shí)間。該方法既保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,又大大提升檢驗(yàn)效率。另外,本研究方法還提供噠螨靈、毒蟲畏、呋蟲胺、久效磷、肟菌脂、溴氰菊酯、唑蟲酰胺、嘧霉胺和炔螨特的回收率,為補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)方法提供數(shù)據(jù)積累。

表3 QuEChERS方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法 對28種農(nóng)藥回收率的對比Table 3 Comparison of recoveries of 28 pesticides between QuEChERS and the nationl standaeds

續(xù)表

表4 QuEChERS方法和國家標(biāo)準(zhǔn)方法 2種農(nóng)藥結(jié)果與Fapas結(jié)果定值的對比Table 4 Comparison of Fapasassigned value of 2 pesticides between QuEChERS and the nationlstandaeds

2.9 實(shí)際樣品檢測

利用本法和國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 23200.13 -2016對Fapas能力驗(yàn)證的茶葉樣品進(jìn)行測試,樣品中檢出毒死蜱和殺螟硫磷的結(jié)果列于表4,結(jié)果滿意,說明本法的準(zhǔn)確性較高。

3 結(jié)論

本文采用QuEChERS方法進(jìn)行前處理,以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜為檢測儀器,建立茶葉中農(nóng)藥殘留的篩查檢測方法。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,28種農(nóng)藥在3個(gè)添加水平下的回收率為72.5%～118.5%,檢出限為0.08～1.26 μg/kg,定量限0.28～4.20 μg/kg,RSD為0.8%～16.3%,滿足農(nóng)藥殘留的檢測要求。與傳統(tǒng)樣品預(yù)處理方法相比,在保證方法的靈敏度、精密度和適用性的基礎(chǔ)上,該方法樣品前處理成本低,簡便快速,靈敏可靠,適合于茶葉中農(nóng)藥殘留的定性、定量分析。