劉 娟，王 舒，左 周，路 暢，蔡春波，楊 陽，趙 燕，高鵬飛

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

豬肌肉中脂肪層次多，結(jié)締組織少，是人們獲取營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源之一，深受人們喜愛[1-2]。隨著我國社會經(jīng)濟的快速進(jìn)步和發(fā)展，人們對于肉品質(zhì)的追求也逐步提高，營養(yǎng)綠色保健型肉品成為了人們新的追求[3]。肌肉中的脂肪對肉的嫩度、多汁性和風(fēng)味有重要影響，而脂肪酸是脂肪沉積的物質(zhì)基礎(chǔ)[4]。脂肪酸的組成不同，會對肉的風(fēng)味和營養(yǎng)特性產(chǎn)生影響。單不飽和脂肪酸比多不飽和脂肪酸具有更強的氧化穩(wěn)定性，能改善肉的口感和色澤[5]，而多不飽和脂肪酸降低了人們患心血管疾病的風(fēng)險[6]。因此，構(gòu)建與脂肪酸組成相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵調(diào)控分子是非常必要的。

迄今為止，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)獲得了很多影響脂肪酸組成的關(guān)鍵mRNA以及l(fā)ncRNA。已有研究表明，長鏈脂酰輔酶A合成酶1（ACSL1）可參與吸取外來脂肪酸的調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)油酸的攝入而增加甘油三酯中油酸的沉積，提高細(xì)胞內(nèi)不飽和脂肪酸的沉積[7]。CRIADO-MESAS等[8]通過GWAS分析發(fā)現(xiàn)，不同豬品種胰島素樣生長因子2（IGF2）存在多態(tài)性，攜帶A等位基因的動物IGF2表達(dá)增加，則多不飽和脂肪酸含量升高、單不飽和脂肪酸含量降低。SHANG等[9]以藏豬和大白豬為研究對象，分析2個品種脂肪酸組成顯著差異的分子機制，結(jié)果表明，長非編碼RNAMSTRG.14097和MSTRG.8034等在脂肪和脂肪酸組成性狀中發(fā)揮重要作用。據(jù)報道，lncRNA-PU.1可以和mRNA形成雙鏈復(fù)合物，抑制PU.1基因的翻譯過程，進(jìn)而可以調(diào)節(jié)脂肪的形成[10]。lncRNA-Blnc1在小鼠中形成核糖核蛋白，與EBF2組成復(fù)合體，增強棕色和米色脂肪細(xì)胞分化[11]。

加權(quán)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）是用于加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析的R包，可以用作數(shù)據(jù)探索工具或基因篩選（排序）方法來查找高度相關(guān)的基因的簇（模塊）[12]。YANG等[13]利用WGCNA篩選膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的候選生物標(biāo)志物，并進(jìn)行分子機制研究。MAERTENS等[14]通過WGCNA分析，顯示了與雙酚A劑量反應(yīng)相關(guān)的新型轉(zhuǎn)錄因子。DING等[15]將WGCNA和血清代謝組學(xué)相結(jié)合揭示了與肺癌相關(guān)的無序葡萄糖代謝過程。

馬身豬和大白豬是品種特性相差非常大的2個豬品種。本研究對馬身豬和大白豬不同生長階段背最長肌組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，采用WGCNA方法進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和模塊查找，找到涉及豬肌肉脂肪酸組成的生物過程和途徑的重要模塊，以期獲得影響豬肌肉脂肪酸組成的關(guān)鍵調(diào)控分子。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與處理

飼養(yǎng)試驗于山西省大同市種豬場進(jìn)行，選用馬身豬和大白豬為研究對象，分別在1日齡、90日齡和180日齡隨機選擇3頭體質(zhì)量相近的去勢公豬屠宰取樣，采集心、肝、脾和背最長肌等8種組織樣品，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

對2個品種的18個樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得不同生長時期肌肉組織mRNA和lncRNA表達(dá)譜，數(shù)據(jù)NCBI登錄號為SRP068558。使用R包limma進(jìn)行差異基因分析，DEG的閾值設(shè)置為|log2（foldchange）|＞0.8且P＜0.05。進(jìn)一步篩選18個樣本中FPKM值均高于1的mRNA和lncRNA。

1.3 WGCNA分析

使用R語言包WGCNA構(gòu)建差異mRNA和lncRNA無尺度網(wǎng)絡(luò)。首先，對所有成對mRNA或lncRNA進(jìn)行相關(guān)性分析，然后利用冪函數(shù)amn＝|cmn|β（cmn表示m和n之間的皮爾森相關(guān)性；amn表示m和n之間的鄰接性；m、n可以是mRNA也可以是lncRNA）構(gòu)建鄰接矩陣。確定軟閾值參數(shù)β，將鄰接矩陣轉(zhuǎn)化為拓?fù)渲丿B矩陣，并計算相應(yīng)的不相似性（1-TOM）。設(shè)置模塊最少基因數(shù)為30，基于TOM的度量方法進(jìn)行層次聚類，將表達(dá)譜相似的mRNA、lncRNA劃分為同一模塊。

將模塊特征基因（MEs）作為各基因模塊的特征向量，代表各模塊基因的表達(dá)模式。此外，計算MEs與11種脂肪酸（棕櫚酸（Pal）、硬脂酸（Ste）、油酸（Ole）、亞油酸（Lin-2）、亞麻酸（Lin-3）、花生酸（Ara）、花生酸-烯酸（Ara-4）、飽和脂肪酸（SFA）、不飽和脂肪酸（UFA）、單不飽和脂肪酸（MUFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA））之間的相關(guān)性。

1.4 功能富集分析

為探索模塊中潛在的生物學(xué)功能和基因途徑，使用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）對基因參與的生物學(xué)過程以及信號通路進(jìn)行注釋。結(jié)合模塊特征基因與性狀相關(guān)性以及富集分析結(jié)果，確定感興趣模塊。利用Cytoscape插件ClueGO將篩選到的模塊基因的生物學(xué)過程、信號通路以及一些mRNA組成的網(wǎng)絡(luò)圖可視化。

1.5 模塊樞紐基因的選定

在分析一個網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點時，就要提到度（Degree）這個概念，假如有50個基因，有30個基因和A基因相連，那么A基因的度就是30。cyto Hubba是一款基于軟件Cytoscape進(jìn)行運算的插件[16]，利用軟件中的Degree算法來篩選一個網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因。本研究設(shè)置樞紐基因個數(shù)為10，并利用Cytoscape 3.6.1軟件將共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)可視化[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)差異的lncRNA和mRNA

為建立基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，選取18個樣本的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，使用R進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理。R包注釋用來匹配探針到基因symbol，匹配到多個基因的探針被去除，一個基因匹配到多個探針的，中值作為最終的表達(dá)值。剔除不同樣本中FPKM值小于1的mRNA和lncRNA，最終得到4139條mRNAs和322條lncRNAs。

2.2 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

共表達(dá)分析包括18個樣本和11個脂肪酸組成性狀。利用R中的“WGCNA”包，通過平均連鎖層次聚類將表達(dá)模式相似的差異基因劃分為一個模塊。選擇β＝7作為軟閾值，以保證構(gòu)建無尺度網(wǎng)絡(luò)。設(shè)置模塊最少基因數(shù)為30，劃分為15個模塊（圖1）。

根據(jù)基因表達(dá)模塊的表達(dá)趨勢與脂肪酸組成的變化趨勢進(jìn)行相關(guān)性分析（圖2）。MEturquoise模塊與硬脂酸呈顯著正相關(guān)（r＝0.58，P＝0.01）；MEgreenyellow模塊與亞油酸呈極顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.73，P＝ 0.0005），與多不飽和脂肪酸呈顯著正相關(guān)（r＝0.55，P＝0.02）；亞麻酸與MEyellow模塊呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.65，P＝0.004），與MEbrown和MEgreen模塊均呈顯著正相關(guān)（r＝0.56，P＝0.01；r＝0.63，P＝0.005）；花生酸分別與MEblue、MEpurple和MEblack模塊呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.55，P＝0.02；r＝-0.56，P＝0.02；r＝-0.52，P＝0.03），與MEturquoise、MEgreen、MEtan和MEmagenta模塊呈極顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.63，P＝0.005；r＝-0.73，P＝0.0006；r＝-0.72，P＝0.03；r＝-0.60，P＝0.009），與MEyellow模塊呈顯著正相關(guān)（r＝0.5，P＝0.03）；花生酸-烯酸與MEturquoise模塊呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.57，P＝0.01），單不飽和脂肪酸與MEred模塊呈顯著正相關(guān)（r＝0.54，P＝0.02）。

2.3 富集分析

通過比較模塊與脂肪酸組成的相關(guān)性，選擇MEgreen模塊和MEyellow模塊進(jìn)行深入分析。通過ClueGO的kappa分?jǐn)?shù)統(tǒng)計方法，計算基因生物學(xué)過程、通路以及mRNA的關(guān)聯(lián)性，分別構(gòu)建2個模塊的生物學(xué)功能和通路的互作網(wǎng)絡(luò)。從圖3可以看出，MEgreen模塊基因顯著富集于線粒體ATP合成偶聯(lián)電子傳遞過程、基于?；o酶A脫氫酶脂肪酸β氧化、脂肪酸分解代謝過程等生物學(xué)過程，以及顯著富集于氧化磷酸化、脂肪酸降解、PPAR信號通路等。

由圖4可知，MEyellow模塊基因顯著富集于脂肪酸生物合成過程、脂肪酸β氧化過程和糖原生物合成過程等生物學(xué)過程，并且顯著富集于氧化磷酸化、生熱相關(guān)信號通路以及PPAR信號通路等。根據(jù)富集結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，2個模塊中的基因與脂肪酸組成性狀相關(guān)，但MEgreen模塊基因功能側(cè)重于脂肪酸分解過程，MEyellow模塊基因側(cè)重于脂肪酸合成等生物過程。

2.4 構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

對所有模塊進(jìn)行富集分析后，發(fā)現(xiàn)MEgreen模塊和MEyellow模塊中的基因顯著富集于與脂肪酸組成有關(guān)的信號通路。相關(guān)性分析表明，2個模塊與亞麻酸、花生酸含量等有顯著相關(guān)關(guān)系，因此，對MEgreen模塊和MEyellow模塊進(jìn)行分析。使用軟件Cytoscape 3.6.1對這2個模塊中的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系可視化（圖5），基于cytoHubba插件找出網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點。在每個網(wǎng)絡(luò)中篩選出10個核心基因，其中MEgreen模塊有7個lncRNAs，126個mRNAs，核心基因為NADH脫氫酶1β亞復(fù)合物3（NDUFB3）、NADH脫氫酶1β亞復(fù)合物7（NDUFB7）、NADH：泛醌氧化還原酶亞基AB1（NDUFAB1）、卟啉原氧化酶（CPOX）、NADH：泛素氧化還原酶核心亞基V1（NDUFV1）、ATP合酶F1亞基（ATP5A1）、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶2（CPT2）、ATP合酶外周莖亞基OSCP（ATP5O）、線粒體RRNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MRM1）和電子轉(zhuǎn)移黃蛋白亞基α（ETFA）。

同樣的方法，對MEyellow模塊進(jìn)行分析（圖6），其中有9個lncRNAs，156個mRNAs，核心基因為肌肉相關(guān)的糖原磷酸化酶（PYGM）、泛素結(jié)合酶E2 D4（UBE2D4）、磷酸甘油酸酯變位酶2（PGAM2）、脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶相互作用蛋白2（PSTPIP2）和葡萄糖磷酸變位酶1（PGM1）、包含E3泛素蛋白連接酶的WW結(jié)構(gòu)域1（WWP1）、包含5A的DENN域（DENND5A）、肌動蛋白相關(guān)蛋白1B（ACTR1B）、單ADP核糖水解酶1（MACROD1）和Cullin締合類泛素化酶解離2（CAND2）。

3 結(jié)論與討論

本研究采用WGCNA方法，通過表達(dá)特性對mRNA、lncRNA進(jìn)行模塊聚類分析。與通常根據(jù)差異性和表達(dá)量篩選候選基因的方法不同[18]，WGCNA根據(jù)基因表達(dá)特征進(jìn)行歸類，再通過互作網(wǎng)絡(luò)的連通度篩選基因，保留了潛在的新調(diào)控因子。從組學(xué)大數(shù)據(jù)整體視角，獲得了與脂肪酸組成相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并篩選模塊中的關(guān)鍵分子。

通過構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，分別從MEgreen模塊和MEyellow模塊篩選到10個核心基因和若干個lncRNAs。其中，NDUFAB1、NDUFV1、CPT2和ATP5O等均是MEgreen模塊的關(guān)鍵基因。NDUFAB1可能是通過增強線粒體新陳代謝來預(yù)防肥胖和胰島素抵抗的線粒體靶標(biāo)[19]。NDUFV1是涉及氧化應(yīng)激和ATP產(chǎn)生的重要亞基，可為母豬腹中胎兒發(fā)育提供能量[20]。CPT2被運輸?shù)骄€粒體內(nèi)膜，與肉堿棕櫚基轉(zhuǎn)移酶I一起，編碼的蛋白質(zhì)可使線粒體中的長鏈脂肪酸氧化[21]。CPT2下調(diào)可使肝細(xì)胞癌適應(yīng)脂類豐富的環(huán)境，并通過肥胖中的?；鈮A積累促進(jìn)其發(fā)生癌變[22]。ATP5O作為氧化磷酸化相關(guān)的酶基因，可能通過上調(diào)LncRNAROR促進(jìn)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向褐色脂肪細(xì)胞分化[23]。WWP1、PSTPIP2、PGAM2和PGM1等是MEyellow模塊中的關(guān)鍵基因，通過功能富集發(fā)現(xiàn)，該模塊在氧化磷酸化、脂肪酸代謝等功能通路具有重要作用。PSTPIP2是一種與自身炎性疾病相關(guān)的蛋白，它參與巨噬細(xì)胞的活化、嗜中性粒細(xì)胞的運動和破骨細(xì)胞的分化等作用[24]。PGAM2位于線粒體中，參與氧化磷酸化作用[25]。PGM1對肥胖有一定的作用[26]。KOBAYASHI等[27]通過過表達(dá)與敲低等細(xì)胞試驗證明，WWP1對脂肪細(xì)胞中的氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用。大量的lncRNA被發(fā)現(xiàn)在發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。本研究基于WGCNA方法分別從MEgreen、MEyellow模塊篩選得到7條和9條lncRNAs。這些lncRNA在豬肌肉脂肪酸組成中的作用機制還有待進(jìn)一步驗證。

本研究利用R語言包“WGCNA”對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和脂肪酸組成數(shù)據(jù)相結(jié)合，是目前比較流行的數(shù)據(jù)分析手段。一些疾病的臨床數(shù)據(jù)研究都集中于利用WGCNA方法，發(fā)現(xiàn)了很多與胃癌[28]和阿爾茲海默癥[29]等疾病檢測、發(fā)展、治療的靶點，具有很高的應(yīng)用價值。而在動物科學(xué)研究中，采用WGCNA方法篩選影響生產(chǎn)性能的關(guān)鍵分子的研究還很少。本研究采用WGCNA方法構(gòu)建了與豬肌肉脂肪酸組成有關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)掘影響豬肌肉品質(zhì)的關(guān)鍵分子。但還存在很多不足，這些關(guān)鍵mRNA以及l(fā)ncRNA對豬肌肉脂肪酸組成的具體分子機制還有待驗證。

本研究采用WGCNA方法對2個品種豬的肌肉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，構(gòu)建了2個共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，篩選了20條關(guān)鍵mRNAs和16條lncRNAs。發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因中的NDUFAB1、ATP5A1和NDUFB7等基因主要在線粒體上參與氧化磷酸化過程，對豬肌肉脂肪酸組成有重要作用。本研究結(jié)果可為豬品質(zhì)形成的分子機制研究提供理論參考。