章雨璐 呂寶乾 楊帆 涂艷 蔣方一丁 齊可欣 李紫城

摘? 要：椰心葉甲（Brontispa longissima Gestro）是近年來危害棕櫚科植物的主要入侵害蟲之一，能夠?qū)Χ喾N棕櫚科植物造成嚴重危害。本研究通過對椰心葉甲腸道共生菌進行分離培養(yǎng)，并鑒定其相關(guān)功能，以探究腸道共生菌對椰心葉甲環(huán)境適應(yīng)性的作用。對椰心葉甲幼蟲腸道共生菌進行分離培養(yǎng)，提取DNA以通用引物擴增鑒定后，以透明圈染色實驗對纖維素、木聚糖和果膠功能進行分析。椰心葉甲幼蟲腸道中分離得到22株細菌和2株真菌，其中可培養(yǎng)細菌的優(yōu)勢菌群為變形菌門（Proteobacteria）。芽孢桿菌屬細菌具有降解纖維素和木聚糖的能力，而帶化紅球菌具有降解木聚糖的能力。椰心葉甲腸道中具有能夠降解纖維素與木聚糖的微生物，并占據(jù)一定優(yōu)勢地位，因此椰心葉甲能夠取食危害多種纖維素含量較高的棕櫚科植物，而這一類腸道共生菌對于椰心葉甲入侵過程中的適應(yīng)性也提供了一定的幫助。

關(guān)鍵詞：椰心葉甲;腸道微生物;多樣性;功能分析

中圖分類號：S433.5? ? ? 文獻標識碼：A

Isolation， Identification and Functional Analysis of Intestinal Microorganisms of Brontispa longissimi Gestro

ZHANG Yulu1，2， LYU Baoqian2*， YANG Fan1， TU Yan1，2， JIANG Fangyiding1，2， QI Kexin1，2， LI Zicheng3

1. School of Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Institute of Environment and Plant Protection， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitoring and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Institute of Entomology， College of Agriculture and Biotechnology， Zhejiang University， Hangzhou， Zhejiang 310058， China

Abstract： Brontispa longissima Gestro is one of the major invasive pests of Palmae in recent years， which has great damage to many Palmae plants. In this paper， we isolated and cultured the intestinal symbiotic bacteria of B. longissimi Gestro， and identified its related functions， in order to explore the role of intestinal symbiotic bacteria on the environmental adaptability of B. longissimi Gestro. The intestinal symbiotic bacteria of B. longissimi Gestro were isolated and cultured， DNA was extracted， amplified and identified with universal primers， and analyzed its function by transparent circle staining experiment. 22 culturable bacteria and 2 fungi were isolated and sequenced from the larval intestines. The gut bacteria were dominated by Proteobacteria. Preliminary functional analysis proved biodegradable activity on cellulose of the strains of Bacillus and xylan of the strains of Rhodococcus fascians. There were microorganisms that could degrade cellulose and xylan in the intestines of B. longissimi Gestro， and they occuped a certain dominant position. Therefore， B. longissimi can damage a variety of Palmae plants with high cellulose content， and this kind of intestinal symbiotic bacteria also provide some help for the adaptability of B. longissimi Gestro to the new environment.

Keywords： Brontispa longissimi Gestro; gutmicrobiota; diversity; functional analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.023

椰心葉甲（Brontispa longissima Gestro）屬鞘翅目鐵甲科昆蟲，2002年傳入中國后，迅速爆發(fā)成災(zāi)，成為危害我國棕櫚科植物的主要外來入侵害蟲之一。椰子是海南的主要經(jīng)濟作物之一，椰心葉甲的成蟲和幼蟲主要取食危害椰子的心葉部分。受害心葉伸展后變?yōu)榭蔹S狀，呈火燒狀，受害嚴重時會導致植株死亡[1]。椰心葉甲入侵我國南方，爆發(fā)后對當?shù)亟?jīng)濟和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了嚴重的影響。昆蟲體內(nèi)存在著許多微生物，而在其腸道中更是有許多與昆蟲生長發(fā)育息息相關(guān)的共生菌。昆蟲腸道系統(tǒng)受環(huán)境影響具有多樣性，該多樣性在一定程度上與昆蟲種類、食性、殺蟲劑抗性機制、宿主的生理功能密切相關(guān)[2-3]。隨著社會高速發(fā)展，近年來，對環(huán)境保護高度重視，這促進了對昆蟲腸道微生物的研究，同時測序技術(shù)、組學技術(shù)等分子檢測手段不斷發(fā)展，使得對于昆蟲腸道微生態(tài)和腸道微生物的研究有了更完善的鑒定手段[4-5]，這也使有關(guān)昆蟲腸道共生菌和寄主昆蟲的互作越來越成為國內(nèi)外關(guān)注的熱點之一。昆蟲和其腸道微生物處在一個共生的關(guān)系中，大多數(shù)共生菌對于昆蟲的生長發(fā)育、食物消化、免疫等方面具有一定的影響。而腸道作為昆蟲消化系統(tǒng)的重要組成部分，其中的共生菌對于昆蟲食性的選擇、對食物的降解代謝起到重要的作用[6]。大部分植食性昆蟲的腸道微生物可以參與昆蟲取食時對細胞壁的降解。纖維素和半纖維素是植物細胞壁的重要組成部分，棕櫚植物纖維含量高[7]。但大部分昆蟲缺乏降解纖維素的酶，從而影響消化。在對昆蟲腸道微生物的研究中發(fā)現(xiàn)象白蟻屬（Nasutitermes）腸道共生菌能夠降解木質(zhì)纖維素[8]。果膠是植物細胞壁另一組成，而在意大利蜜蜂（Apis mellifera）腸道中也發(fā)現(xiàn)了能降解果膠的共生菌[9]，這也說明了昆蟲腸道共生菌可能在某種程度上影響了昆蟲對于寄主的選擇。目前針對昆蟲腸道共生菌的研究已經(jīng)越來越多，但有關(guān)椰心葉甲腸道共生菌卻尚無涉獵，想要了解這些共生菌在腸道中的多樣性及其和椰心葉甲之間的互作，需采用傳統(tǒng)分離純培養(yǎng)的方法進行初步的分析驗證。本研究的重點是以傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和現(xiàn)代分子生物學方法相結(jié)合的方式，得到并鑒定出可培養(yǎng)腸道微生物的種類，開展其后續(xù)功能性分析[10]。

1? 材料與方法

1.1? 椰心葉甲的飼養(yǎng)

椰心葉甲以椰子葉片作為飼料，在溫濕度分別為（252）℃、RH=75%10%條件下大量飼養(yǎng)備用。

1.2? 椰心葉甲腸道內(nèi)含物的提取

取健康6齡幼蟲50頭，先用無菌水，再用75%酒精擦拭清潔幼蟲體表，并用75%酒精浸泡3 min做體表消毒。無菌條件下解剖蟲體，取其腸道，并放入無菌生理鹽水中漂洗3次，再加入1 mL無菌水勻漿，備用。實驗前使其饑餓24 h，排空體內(nèi)食物殘渣。

1.3? 椰心葉甲和椰子織蛾腸道微生物的分離純化

細菌：將上述提取的內(nèi)含物按10?3、10?4、10?5、10?6、10?7、10?8、10?9、10?10、10?11、10?12梯度稀釋，各取0.1 mL涂液，同時取0.1 mL無菌水作為對照組。采用LB培養(yǎng)基，涂布后將平板置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每24 h觀察1次。用接種環(huán)或解剖針，按菌落的大小、顏色和形態(tài)挑選不同的單菌落在新的LB平板上劃線培養(yǎng)，每個菌落在平板上至少純化5次，得到單克隆菌株，純化得到的菌株接種至斜面培養(yǎng)基置于4 ℃冰箱保存。

真菌：將上述提取的內(nèi)含物制成稀釋液，并以無菌水為對照，采用PDA平板，涂板后置于27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每24 h觀察1次。用接種環(huán)或解剖針，按菌落的大小、顏色和形態(tài)，分離純化單菌落并分別接種于相應(yīng)的PDA斜面培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)備用，為后面提取DNA作準備。

1.4? 椰心葉甲分離細菌16S rRNA和真菌ITS的擴增

將分離純化得到的細菌和真菌送至青島派森諾基因生物技術(shù)有限公司進行PCR擴增及DNA測序。

1.5? 椰心葉甲腸道微生物的菌種測定

通過NCBI Blast程序?qū)z測后的序列文件與NCBI數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，得到與待測物種序列相似度最大的物種信息，即為鑒定結(jié)果。選取單克隆菌株的近緣序列，利用MEGA 7.0軟件以鄰位相連算法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[11]。

1.6? 椰心葉甲腸道分離微生物對纖維素、果膠及木聚糖的降解功能分析

將上述純化得到的菌株分別接種到CPS1（纖維素篩選平板）、PPS1（果膠素篩選平板）、XPS1（木聚糖篩選平板）上。各平板置于恒溫箱培養(yǎng)，30 ℃，培養(yǎng)72 h，為后續(xù)進行產(chǎn)酶鑒定作準備。將能在上述CPS1、PPS1、XPS1平板上生長的菌株分別點至CPS2（纖維素酶鑒定平板）、PPS2（果膠酶鑒定平板）、XPS2（木聚糖酶鑒定平板）上。將各平板置于恒溫箱培養(yǎng)，30 ℃，培養(yǎng)7 d，分別使用剛果紅、溴酚藍、盧戈式碘液進行染色，采用透明圈法，對3種酶的產(chǎn)生菌進行鑒定。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 椰心葉甲腸道共生菌的分離純化與克隆

將椰心葉甲的腸道內(nèi)容物的稀釋液涂布在LB和PDA培養(yǎng)基上，獲得腸道原始菌株。分別從上述培養(yǎng)基中挑選形態(tài)、大小、顏色不一的菌落進行分離純化，共得到24個細菌菌落，7個真菌菌落（依次編號A1-A31）。提取上述菌落的基因組DNA，以提取的細菌和真菌基因組DNA為模板擴增16S rDNA并進行測序，用NCBI Blast程序?qū)z測后的序列文件與NCBI 16S數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對。結(jié)果顯示，除模板不純，可以得到細菌22株，真菌2株。分離后的細菌可能有粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）、伯克氏菌屬（Burkholderia）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillu scereus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、帶化紅球菌（Rhodococcus fascians）、微桿菌（Microbacterium foliorum）。真菌有枝孢屬（Gladaxporism）、曲霉屬（Aspergillus）（表1）。

2.2? 椰心葉甲可分離腸道細菌的構(gòu)成分析

因部分菌株屬于同一菌種，所以選擇其中序列較完整的個別單克隆菌株（分別命名為SQD1906A1、SQD1906A9、SQD1906A5、

SQD1906A12、SQD1906A13、SQD1906A17）的16S rDNA序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖1）。結(jié)果表明，從椰心葉甲腸道分離的可培養(yǎng)細菌主要由變形菌? ?門（Proteobacteria）、厚壁? ? 菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）組成。其中腸桿菌（Enterobacteraceae）和伯克氏菌（Burkholderia）屬于變形菌門γ-變形菌綱的分枝，其中伯克氏菌屬于伯克氏菌科，原屬于假單胞菌科，沙雷氏菌屬于腸桿菌目的腸桿菌科;芽孢桿菌（Bacillus）屬于厚壁菌門的分枝，且屬于芽孢桿菌綱，其中蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌屬于芽孢桿菌目的芽孢桿菌科;微桿菌（Microbacterium）和紅球菌（Rhodococcus）屬于放線菌門的分枝，屬于放線菌目的微球菌科。

2.3? 椰心葉甲腸道共生菌的功能鑒定

前期研究表明，椰心葉甲腸道對纖維素、果膠和木聚糖具有降解作用，對分離培養(yǎng)出的菌種進行功能驗證。本研究選取從椰心葉甲腸道中分離出的細菌，分析其對纖維素、果膠和木聚糖的

降解能力。結(jié)果表明，A15（芽胞桿菌）對纖維素具有降解能力（圖2），同時對木聚糖也具有降解能力（圖3A）;A12（帶化紅球菌）對木聚糖具有降解能力（圖3B）。

3? 討論

昆蟲體內(nèi)通常存在著許多微生物，是昆蟲生長發(fā)育不可或缺的一部分。這些微生物或輕或重地影響著昆蟲的取食消化、生長發(fā)育或免疫能力。不同昆蟲腸道內(nèi)微生物的種類、數(shù)量、分布及功能等均不同[12]。目前發(fā)現(xiàn)變形菌門是存在于昆蟲腸道中共生菌最大的一個門類，其中在很多昆蟲腸道中均有發(fā)現(xiàn)腸桿菌、檸檬酸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、假單胞菌和伯克氏菌等[13]。厚壁菌門和擬桿菌也在許多昆蟲體內(nèi)通過分離得到。這些微生物和昆蟲處在一個共生的關(guān)系中，對昆蟲的生長發(fā)育起到不可忽略的作用，如對昆蟲免疫系統(tǒng)、抗藥性、壽命等方面的互作關(guān)系。利用甲維鹽喂食斜紋夜蛾（Spodoptera litura）發(fā)現(xiàn)其腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而可以起到防治作用[14]。同時腸道作為昆蟲消化器官，其中大部分共生菌都對昆蟲的營養(yǎng)代謝有一定的影響，包括對纖維素的降解、必要氨基酸的合成等方面。在木食性的松墨天牛（Monnochamus alternatus Hope）的腸道中，通過選擇培養(yǎng)實驗得到了多種具有木質(zhì)纖維素降解能力的菌種[15]。

本研究通過利用傳統(tǒng)微生物分離純培養(yǎng)的方法，從椰心葉甲腸道中共分離出22株細菌和2株真菌。其中細菌分別屬于變形菌門（13株）、厚壁菌門（6株）和放線菌門（3株），變形菌門為優(yōu)勢菌群。真菌屬于半知菌門（1株）和子囊菌門（1株）。其中芽孢桿菌具有降解纖維素和木聚糖的能力，帶化紅球菌具有降解木聚糖的能力。蔣宇[15]在對華美奧鍬甲（Odontolabis fallaciosa）的腸道微生物多樣性研究中發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和變形菌門是豐度最高的，在家蠶（Bombyx mori）的研究中也發(fā)現(xiàn)同樣的結(jié)果[16]，而在本研究中，可培養(yǎng)的優(yōu)勢菌群也屬于變形菌門，該結(jié)果與目前研究發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)昆蟲腸道優(yōu)勢菌相同。昆蟲腸道內(nèi)的微生物對植物細胞壁的降解和營養(yǎng)的供給起到重要的作用，而纖維素、果膠和木聚糖是植物細胞壁的主要組成部分[17]。孫博通等[18]在斜紋夜蛾（Spodoptera litura）的腸道中發(fā)現(xiàn)能夠降解纖維素的腸桿菌，而在本研究中發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌可能也具有對纖維素的降解能力，同時該芽孢桿菌也能夠降解木聚糖，可能對椰心葉甲的營養(yǎng)吸收具有一定的影響。此外，在研究中還發(fā)現(xiàn)對木聚糖有降解能力的帶化紅球菌，并未發(fā)現(xiàn)對果膠具有降解能力的菌株。而夏曉峰等[19]在對小菜蛾（Plutellaxy lostella）中腸微生物的研究中發(fā)現(xiàn)，小菜蛾中腸細菌對纖維素和果膠的降解能力較強，對木聚糖的降解能力較弱，與椰心葉甲不同。推測是因為不同昆蟲對降解物質(zhì)的需求有差異而造成的[20]。棕櫚科植物是椰心葉甲的主要寄生對象，而大部分棕櫚科植物的葉片纖維素含量較高。椰心葉甲腸道共生菌具有降解纖維素和木聚糖的能力，且有相對優(yōu)勢，對于其選擇棕櫚植物為寄主可能有一定的影響，這類腸道共生菌的存在為椰心葉甲入侵海南危害棕櫚植物提供了生理條件。對于昆蟲體內(nèi)微生物的研究主要集中于2種方式，一是通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法，但是由于培養(yǎng)環(huán)境或技術(shù)的限制，往往具有局限性;另一種是通過現(xiàn)代分子生物學的方法，基于對核酸序列的分析，鑒定和認識生態(tài)環(huán)境中還未了解的微生物種群[20]。椰心葉甲幼蟲體型較小，在抽取腸道的過程中，不能保證完整地獲得其腸道。且由于采用的是傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法，可能會存在因為培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法無法滿足菌株的自然生態(tài)條件而出現(xiàn)不確定性，同時腸道中存有許多厭氧菌種，不能通過傳統(tǒng)方法分離培養(yǎng)，所以獲得的結(jié)果可能具有局限性，接下來可以通過測序技術(shù)來進行鑒定。本研究只是初步驗證了分離菌株的功能，但并未對這些菌株的酶活力進行進一步測定，還需后續(xù)進一步研究分析。椰心葉甲腸道中的菌種豐富，除了已驗證的功能外，還可以發(fā)現(xiàn)更多其他功能。

昆蟲腸道是一個存在于昆蟲體內(nèi)的小型生態(tài)系統(tǒng)，腸道微生物與寄主大多處在一個共生環(huán)境中。椰心葉甲的幼蟲和成蟲主要取食椰子心葉，卻極少取食葉片其他部分，可能與椰心葉甲腸道內(nèi)微生物的組成有很大聯(lián)系。研究結(jié)果顯示椰心葉甲中腸微生物在一定程度上幫助其更好地取食消化，提高了椰心葉甲寄生的寄主適應(yīng)度[21]。對于昆蟲腸道微生物的研究已經(jīng)有越來越多的學者介入，本研究為未來更深入地了解椰心葉甲提供了參考，可以進一步發(fā)現(xiàn)通過微生物對椰心葉甲進行生物防治的方法。

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責任編輯：謝龍蓮