王曉芳，孫 亮，王 雷，梁 棟，鄂詩瑀，徐誠煒，王家歡，劉 彬

(遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

0 引言

卡博替尼(CBZ)是一種小分子多靶點酪氨酸梅抑制劑，廣譜抗腫瘤藥，用于治療甲狀腺髓樣癌、腎細胞癌、前列腺癌、晚期肝癌等疾病.但是，使用不當可引起出血、胃腸穿孔、高血壓、血栓栓塞、腹瀉、嘔吐等不良反應(yīng)[1].血清白蛋白是人與動物血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，它在生物體中起著血液緩沖劑、維持血液滲透壓、載運等作用，藥物吸收后最先會與其結(jié)合.因此，研究藥物與血清白蛋白的相互作用，對于了解藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)、運輸、吸收、代謝及藥理作用具有重要意義.而牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白有70%以上的同源性，因此BSA常被用來代替人血清白蛋白被選作模型蛋白[2].

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

紫外-可見分光光度計(UV-2550型，日本島津公司)；熒光光譜儀(F-7000型，日本日立公司)；CBZ(遼寧大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)研究室自制)；BSA(上海麥克林生化科技有限公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris：生化試劑，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；氯化鈉(沈陽新化試劑廠)；其他試劑均為市售分析純，實驗用水為雙蒸水.

1.2 實驗方法

首先，用pH=7.4的NaCl-Tris-HCl緩沖液配制實驗中所需的各種溶液.室溫下，在200～600 nm范圍內(nèi)，分別掃描濃度為1.0×10-5mol·L-1的CBZ溶液、BSA溶液和上述溶液等體積混合后生成的CBZ-BSA混合溶液紫外光譜.然后，采用熒光滴定法考察CBZ與BSA間相互作用.將不同體積1.0×10-3mol·L-1的CBZ溶液逐步滴加到裝有2.5 mL 1.0×10-5mol·L-1BSA溶液的1 cm石英比色皿中(滴定劑累加體積不大于0.05 mL)，每次加入CBZ溶液后混合均勻，靜置5 min后，于278 nm激發(fā)波長下進行熒光掃描.發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度均為5 nm，掃描波段范圍200～800 nm，掃描速度1 200 nm·min-1.

2 結(jié)果與討論

2.1 CBZ與BSA相互作用的紫外光譜

圖1 BSA、CBZ及CBZ-BSA混合體系的紫外光譜1.CBZ；2.BSA；3.BSA+CBZ；4.CBZ-BSA混合溶液([BSA]=[CBZ]=1.0×10-5 mol·L-1)

有文獻報道[3]，動態(tài)淬滅只影響到熒光體分子的激發(fā)態(tài)，并不改變熒光體的吸收光譜；相反在靜態(tài)淬滅中，基態(tài)配合物的生成往往會導(dǎo)致熒光體的吸收光譜的改變.圖1為CBZ、BSA及CBZ-BSA體系的紫外吸收光譜圖.

由圖1可見，CBZ的加入不僅使BSA在278 nm處的吸收峰強度升高，而且CBZ-BSA復(fù)合體系的吸收光譜與單獨CBZ和BSA吸收光譜的數(shù)學(xué)加和不一致(圖中虛線)，說明該現(xiàn)象的發(fā)生不是CBZ與BSA簡單混合導(dǎo)致的，而是CBZ的確與BSA的基態(tài)分子發(fā)生了相互作用，形成了基態(tài)配合物，從而初步推斷CBZ很可能使BSA發(fā)生靜態(tài)淬滅[4].

2.2 CBZ與BSA相互作用的熒光光譜

BSA分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等內(nèi)源性熒光的物質(zhì)，因此熒光光譜經(jīng)常用來研究藥物與BSA分子之間的相互作用.由圖2可見，隨著CBZ濃度增大，BSA的最大發(fā)射熒光峰強度逐步降低，稱為熒光淬滅，同時也表明CBZ與BSA之間存在相互作用.熒光淬滅過程一般分為靜態(tài)淬滅和動態(tài)淬滅，通常可借助動態(tài)淬滅常數(shù)的大小及溫度對淬滅過程的影響判斷其淬滅類型.應(yīng)用Stern-Volmer方程對CBZ引起B(yǎng)SA熒光淬滅的數(shù)據(jù)進行處理[5]：

圖2 CBZ與BSA相互作用的熒光光譜([BSA]=1.0×10-5 mol·L-1)

F0/F=1+KSV[Q]

(1)

其中，F(xiàn)和F0分別代表加入和不加CBZ時BSA的熒光強度，KSV為動態(tài)淬滅常數(shù)，[Q]為CBZ濃度.根據(jù)圖2中343 nm處的熒光強度變化值，由式(1)作出BSA熒光淬滅的Stern-Volmer曲線，再根據(jù)直線斜率及截距可求出不同溫度CBZ與BSA相互作用的KSV，5.2×104L·mol-1(293K)；5.4×104L·mol-1(303K)；5.7×104L·mol-1(310K).數(shù)值均在104數(shù)量級，說明CBZ對BSA有極強的淬滅作用.隨著反應(yīng)體系溫度的升高，KSV略有升高，表明CBZ與BSA的激發(fā)態(tài)分子間發(fā)生相互作用，并且在相互碰撞過程中會發(fā)生能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移，從而引起B(yǎng)SA熒光發(fā)生動態(tài)淬滅.綜上，CBZ與BSA間相互作用很可能是一個聯(lián)合淬滅過程.一般講，對于聯(lián)合淬滅過程，可以用修正Stern-Volmer方程來驗證[6].

F0/F=(1+KD[Q])(1+KS[Q])=1+(KD+KS)[Q]+KDKS[Q]2

(2)

式中KD為動態(tài)淬滅常數(shù)，KS靜態(tài)淬滅常數(shù)，其它參數(shù)含義同公式(1)，繪制修正Stern-Volmer曲線，見圖3.如圖所示，可看到三條微向下彎曲的曲線，進一步確證BSA的熒光淬滅機理為聯(lián)合淬滅[6-7].

圖3 修正的Stern-Volmer曲線

2.3 CBZ與BSA的相互作用模式

結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)通常用來描述分子之間相互作用模式，該項參數(shù)可由公式(3)修正的雙對數(shù)方程獲得.

lg[(F0-F)/F]=nlgKa+nlg{[Q]-n[P](F0-F)/F0}

(3)

式中的[Q]、[P]分別為CBZ和BSA的總濃度，n為結(jié)合位點數(shù)，由式(3)作lg[(F0-F)/F]-lg[Q]圖，可根據(jù)圖中直線的斜率及截距計算不同溫度下CBZ與BSA表觀結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n.計算結(jié)果為T=293 K，Ka=5.06×104L·mol-1，n=0.913 7；T=310 K，Ka=4.34×104L·mol-1，n=0.730 1，表明CBZ和BSA分子之間具有較強的相互作用，且形成1∶1形式的配合物.進一步，根據(jù)熱力學(xué)公式(4)和(5)可以求得結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)ΔG=-26.39 kJ mol-1、ΔH=0.945 kJ·mol-1、ΔS=92.28 J·mol-1·K-1.

lnKa=-ΔH/RT+ΔS/R

(4)

ΔG=-RTlnKa=ΔH-TΔS

(5)

ΔG<0表明CBZ與BSA的相互結(jié)合是自發(fā)的，同時，ΔH和ΔS均為正值，這表明CBZ與BSA之間的主要作用力是疏水作用[7].

3 結(jié)論

本研究借助紫外光譜法、熒光光譜法和熱力學(xué)理論等手段，考察了CBZ與BSA之間的相互作用.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CBZ可以使BSA內(nèi)源性熒光發(fā)生淬滅，其淬滅類型屬于動、靜態(tài)聯(lián)合方式.此外，在CBZ分子與BSA間存在較大相互作用，且其主要依靠疏水作用力生成1∶1形式的配合物，該研究對于從分子水平上研究CBZ合理應(yīng)用具有重要意義.