潘潔菁 賀博武 張婷婷 陳曦 姚嘉明 陳芝蕓*

肝內(nèi)膽汁淤積主要是因膽汁分泌過多或排泄障礙，致膽汁酸和有毒物質(zhì)潴留，損傷肝細(xì)胞，形成膽汁淤積性肝病，嚴(yán)重可發(fā)展成肝纖維化、膽汁性肝硬化［1］。而膽小管膽汁形成是滲透性分泌過程，依靠滲透梯度使水分子進入膽管。而位于肝細(xì)胞內(nèi)、基側(cè)膜和膽管膜的水通道蛋白（AQPs）是關(guān)鍵。而大黃可護肝利膽，為治濕熱黃疸的要藥。本研究采用異硫氰酸-α-萘酯灌胃建立急性肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷模型，觀察大黃水浸液對急性肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷大鼠肝臟水通道蛋白8（AQP8）表達(dá)的影響，并探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，SPF級，8周齡，體重190~210 g，由上海西普爾-必凱實驗動物中心提供［動物許可證號：SCXK（滬）2013-0016］。

1.2 大黃水浸液制備 由生大黃100 g加10倍量沸水浸泡20 min后，制成0.6 g/ml濃度生大黃浸出液備用。

1.3 主要試劑 異硫氰酸-α-萘酯（1-Naphthyl isothiocyanate，ANIT）由美國ThermoFisherACROS ORGANICS公司提供。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（產(chǎn)品號：14127070201）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（14126070201）、總膽紅素（TBIL）試劑盒（14108170201）為德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司產(chǎn)品，大鼠胰高糖素（Glucagon，GC）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（H183-1-1）由南京建成生物工程研究所有限公司提供?？俁NA提取試劑盒（9767）為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液（AG11706）、SYBR Green pro Taq HS 預(yù)混gajfqPCR試劑盒（AG11701）為湖南艾科瑞生物工程有限公司產(chǎn)品。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計并合成：AQP8 Forward primer：5'-GGA CAC TTC AAC CCT GCT GT-3'，Reverse primer：5'-CTG GAC TCA CCA CCT TAG CC-3'，產(chǎn)物片段136 bp；β-actin Forward primer：5'- TGT TGC CCT AGA CTT CGA GCA-3'，Reverse primer：5'- CCA TAC CCA GGA AGG AAG GCT-3'，產(chǎn)物片段155 bp。AQP8山羊多克隆抗體（sc-14984）為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG（H+L）（ZB-2306）、DBA顯色試劑盒（ZLI-9019）為北京中杉金橋生物公司產(chǎn)品。

1.4 實驗方法 大鼠隨機分為正常組、模型組、大黃高劑量組和大黃低劑量組，每組8只，實驗第1~4天大黃高、低劑量組分別灌服6.0 g/（kg·d）和3.0 g/（kg·d）大黃水浸液，第3天上午8~9時灌服4% ANIT 100 mg/kg 1次；模型組第1~4天按10 ml/（kg·d）灌服0.9% 氯化鈉液，第3天上午8~9時灌服4%ANIT 100 mg/kg 1次；正常組第1~4天按10 ml/（kg·d）灌服0.9% NaCl，第3天灌服等容量麻油；所有大鼠自由飲水，喂養(yǎng)全價顆粒飼料，于灌服ANIT后48 h（實驗第5天）空腹麻醉下腹腔靜脈取血，分離血清，全自動生化儀檢測AST、ALT、TBIL水平，酶聯(lián)免疫檢測血清胰高糖素水平；分離肝臟，部分提取肝組織總RNA，采用熒光定量PCR法檢測肝組織AQP8mRNA表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，相對表達(dá)量（2-△△Ct）表示目的基因AQP8 mRNA表達(dá)水平；部分以10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，采用免疫組化法檢測肝組織AQP8蛋白表達(dá)，結(jié)果判定：AQP8蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞漿中，光鏡下呈棕黃色細(xì)顆粒狀，根據(jù)AQP8陽性細(xì)胞的著色程度及著色范圍進行半定量［2］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用非參數(shù)秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃水浸液對急性肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷大鼠肝功能及GC的影響 模型組大鼠血清ALT、AST和TBIL水平比正常組增高（P<0.01），大黃高、低劑量組大鼠血清ALT、AST水平及TBIL水平比模型組降低（P<0.05或P<0.01），模型組大鼠血清GC水平比正常組降低（P<0.01），大黃高、低劑量組大鼠血清GC水平比模型組增高（P<0.05或P<0.01）見表1。

表1 大黃水浸液對大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL、GC水平的影響（±s）

表1 大黃水浸液對大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL、GC水平的影響（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01，與模型組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

組別 ALT（IU/L） AST（IU/L） TBIL（IU/L） GC（ng/ml）正常組 46.09±7.99 154.89±17.72 1.89±0.79 653.34±69.67模型組 1322.47±261.27** 2177.96±575.23** 126.81±17.66** 473.23±57.62**大黃高劑量組 805.37±164.92**ΔΔ 1305.10±441.79**Δ 104.65±16.61**Δ 599.68±95.79ΔΔ大黃低劑量組 855.94±227.57**Δ 1432.19±280.89**Δ 113.58±18.90** 553.93±65.22*Δ

2.2 大黃水浸液對急性肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷大鼠肝組織AQP8表達(dá)的影響 模型組大鼠肝組織AQP8mRNA和蛋白表達(dá)比正常組下降（P<0.01），應(yīng)用大黃水浸液高、低劑量干預(yù)后，肝組織AQP8mRNA和蛋白表達(dá)增強（P<0.01，P<0.05），見圖1-2。

圖1 大黃水浸液對急性肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷大鼠肝組織AQP8mRNA及蛋白表達(dá)影響

圖2 大黃水浸液對急性肝內(nèi)膽汁淤積肝損傷大鼠肝組織AQP8蛋白表達(dá)的影響（免疫組化×200）

3 討論

肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷屬于中醫(yī)“黃疸”范疇。臨床治療黃疸的中成藥均含有大黃。張林利［3］等發(fā)現(xiàn)熟大黃使幼齡SD大鼠血清膽紅素及肝酶顯著降低。大黃素治療急性淤膽型肝炎模型大鼠的臨床研究證實有較好療效［4］。現(xiàn)代藥理學(xué)表明［5］大黃可解除膽管括約肌痙攣，增強十二指腸和膽管舒張，疏通膽管和微細(xì)膽小管內(nèi)淤積的膽汁。

肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞可攝取和分泌膽汁，通過依靠可溶性膜蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的協(xié)調(diào)及滲透梯度，完成膽汁分泌并形成膽汁流。膽汁中的活性鹽通過膽鹽輸出泵進入膽小管內(nèi)腔產(chǎn)生滲透梯度，使水分子進入膽管。而膽汁中>95%為水份，故水的轉(zhuǎn)運是形成膽汁流的關(guān)鍵。AQPs［6］是一種具有高選擇性和高效轉(zhuǎn)運水分子的跨膜蛋白。故肝細(xì)胞膽汁的分泌是由膽汁溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體（包括膽鹽輸出泵）和AQPs聯(lián)合作用。

AQPs由一系列膜通道蛋白組成，其中AQP8蛋白主要位于肝細(xì)胞的膽小管膜區(qū)域，負(fù)責(zé)調(diào)控水分子的跨膜轉(zhuǎn)運。研究發(fā)現(xiàn)［7］，大鼠肝細(xì)胞內(nèi)是通過囊泡運輸調(diào)節(jié)膽小管膜上AQP8的數(shù)量，從而調(diào)節(jié)滲透壓介導(dǎo)小管膜水的轉(zhuǎn)運和膽汁形成。水通道蛋白表達(dá)的下降可能導(dǎo)致膽汁生成異常。在膿毒癥相關(guān)、雌激素誘導(dǎo)和肝外梗阻性膽汁郁積癥的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)AQP8的表達(dá)下調(diào)使膽小管水通透性減弱，導(dǎo)致膽汁生成異常［8］。研究發(fā)現(xiàn)高血糖刺激可增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平［9］。胰高血糖素是升血糖激素，也是利膽激動劑，其主要由cAMP依賴的蛋白激酶A介導(dǎo)，在cAMP的刺激下細(xì)胞內(nèi)AQP8重新分配，增加膽小管質(zhì)膜上AQP8的數(shù)量，使細(xì)胞膜水通透性增加，便于水的轉(zhuǎn)運和膽汁形成。而應(yīng)用蛋白激酶A抑制劑可抑制胰高血糖素誘導(dǎo)的AQP8的再分布［10］。

本研究顯示，大黃水浸液干預(yù)能降低ANIT灌胃引起的大鼠血清ALT、AST、TBIL水平升高，提示大黃水浸液可改善急性肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷。同時，ANIT誘導(dǎo)的急性肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷大鼠血清GC水平下降，肝組織AQP8表達(dá)下調(diào)，TBIL異常增高，肝細(xì)胞受損，提示ANIT可能通過降低大鼠胰高血糖的分泌和抑制AQP8的表達(dá)，造成膽汁分泌異常，肝組織受損。應(yīng)用大黃水浸液干預(yù)后，大鼠血清GC水平較模型組增高，肝組織AQP8mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，血清肝功能明顯改善，提示大黃水浸液對急性肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷大鼠胰高血糖素有激動作用并促進肝組織AQP8的活化，這可能是大黃防治急性肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷的重要機制之一，其具體調(diào)節(jié)途徑和機制還需進一步研究探討。