李傳旺 ，張 賀 ，饒 攀 ，鄭東然 ，王 宇 *，李玉花 *

1.黑龍江省植物天然活性物質(zhì)的生物合成與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040

2.東北林業(yè)大學(xué) 東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040

萜類是分子骨架以異戊二烯單元為基本結(jié)構(gòu)單元的化合物及其衍生物，普遍存在于自然界中，是構(gòu)成植物香精、樹脂、色素等次生代謝物的主要成分。根據(jù)萜類分子中異戊二烯單位數(shù)目的不同可分為單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜、多聚萜等。三萜類化合物是一類基本母核由30 個(gè)碳原子組成的重要植物次生代謝產(chǎn)物，在自然界中以游離形式或與糖結(jié)合成苷或酯的形式廣泛存在，具有抗癌、抗病毒、降低膽固醇等藥理作用。三萜類物質(zhì)根據(jù)結(jié)構(gòu)中含環(huán)數(shù)量的不同又分為單環(huán)三萜、雙環(huán)三萜、三環(huán)三萜、四環(huán)三萜和五環(huán)三萜等，其中四環(huán)三萜和五環(huán)三萜化合物種類較多。五環(huán)三萜類化合物的碳骨架存在多種修飾類型，結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，使其具有多種功能而被廣泛關(guān)注。根據(jù)其苷元的不同，可分為齊墩果烷型（如齊墩果酸、甘草酸和山楂酸）、羽扇豆烷型（如白樺酸、羽扇豆醇和白樺脂醇）、烏蘇烷型（如熊果酸和積雪草酸）和木栓烷型（如雷公藤紅素）4 大類，見圖1。

圖1 五環(huán)三萜化合物的4 種主要類型Fig.1 Four main types of pentacyclic triterpenoids

五環(huán)三萜類化合物具有廣泛的藥理作用和重要的生物活性，尤其在抗炎、降血糖、抗腫瘤以及抗艾滋病等方面已經(jīng)顯現(xiàn)良好的藥理特性。如白樺脂醇能通過增加脂肪細(xì)胞中過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）的活性，增強(qiáng)胰島素刺激葡萄糖的吸收[1]；熊果酸可通過減少視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長因子、環(huán)氧化酶-2 和基質(zhì)金屬蛋白酶2 表達(dá)，抑制新生血管的形成，通過抵抗氧化應(yīng)激延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展[2]；積雪草酸通過抑制氧化應(yīng)激和恢復(fù)線粒體功能，改善缺血/再灌注誘導(dǎo)的大鼠肝損傷和缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠肝線粒體損傷[3]；此外，Jamkhande等[4]研究發(fā)現(xiàn)山楂酸具有與抗壞血酸類似的抗氧化活性。近些年來，研究者們不僅對(duì)五環(huán)三萜類化合物藥理學(xué)功能的研究日益增多，而且更多研究者開始關(guān)注對(duì)五環(huán)三萜類化合物生物合成途徑的解析，并取得了一些進(jìn)展。

1 五環(huán)三萜類化合物骨架的合成

植物三萜類化合物的合成主要是通過胞質(zhì)中的甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑和質(zhì)體中的甲基赤蘚糖醇磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途徑。質(zhì)體中由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸經(jīng)由7 個(gè)酶反應(yīng)來合成異戊烯二磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP），IPP 被運(yùn)輸至胞質(zhì)中參與萜類合成。在 IPP 異構(gòu)酶（isopentenyl diphosphateisomerase，IDI）的作用下，IPP 與二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）相互轉(zhuǎn)換。在胞質(zhì)的MVA 途徑中，乙酰輔酶A 為初始供體生成IPP；IPP 與DMAPP 在二磷酸合成酶（farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PS）作用下轉(zhuǎn)化成二磷酸（farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP），又在鯊烯合成酶（squalene synthase，SQS）的作用下合成角鯊烯，然后經(jīng)鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SE）催化轉(zhuǎn)變?yōu)?,3-氧化鯊烯[5]。2,3-氧化鯊烯經(jīng)過氧化鯊烯環(huán)化酶（oxido squalene cyclase，OSC）的環(huán)化生成各種四環(huán)和五環(huán)三萜類骨架。然后這些骨架依賴細(xì)胞色素P450 單加氧酶（cytochrome P450，CYP）和以尿苷二磷酸（uridine diphosphate glycoside，UDP）為糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferase，UGT）進(jìn)行氧化、置換及糖基化等化學(xué)修飾，最終生成各種五環(huán)三萜類化合物（圖2）。

2 OSC 環(huán)化2,3-氧化鯊烯生成五環(huán)三萜類化合物骨架

OSC 可催化2,3-氧化鯊烯生成甾醇和三萜類前體物質(zhì)，是該反應(yīng)的關(guān)鍵酶，也是產(chǎn)生三萜類產(chǎn)物多樣性的關(guān)鍵步驟。OSC 可催化2,3-氧化鯊烯環(huán)化生成100 多種不同碳骨架的三萜類化合物，其催化的環(huán)化作用是經(jīng)一系列的質(zhì)子化、環(huán)化、重排和去質(zhì)子化作用完成的。OSC 催化2,3-氧化鯊烯環(huán)化為不同的構(gòu)象而形成不同的三萜骨架，如大多數(shù)四環(huán)骨架甾醇，包括環(huán)阿屯醇、羊毛甾醇和帕克醇，都是通過椅式-船式-椅式（chair-boat-chair，C-B-C）構(gòu)象衍生出來的。而達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜骨架和大多數(shù)五環(huán)三萜骨架，包括羽扇豆醇和β-香樹脂醇都是通過椅式-椅式-椅式（chair-chair-chair，C-C-C）構(gòu)象的達(dá)瑪烯基陽離子形成[6]。OSC 以基因家族形式存在，該家族成員具有DCTAE 和QW 等高度保守序列。保守序列DCTAE 可能與底物結(jié)合相關(guān)，保守序列QW（QXXXXXW）是帶有負(fù)電性的芳香族氨基酸區(qū)域，其作用是在2,3-氧化鯊烯環(huán)化反應(yīng)中穩(wěn)定碳陽離子，這些重復(fù)序列可能與穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和其功能相關(guān)。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的OSC基因被分離和克隆出來。截至目前已經(jīng)在擬南芥、大豆、苜蓿、白樺、人參、甘草等植物中都發(fā)現(xiàn)了參與五環(huán)三萜類化合物生物合成的OSC（表1）。這些OSC主要催化生成4 種不同的五環(huán)三萜骨架：α-香樹脂醇、β-香樹脂醇、羽扇豆醇和木栓酮（圖2-A）。有些植物中存在多個(gè)β-香樹脂醇合成酶，如蘋果、人參和苜蓿等植物存在催化活性不同的β-香樹脂醇合成酶[7-9]，且OSC 基因具有組織表達(dá)特異性，不同的OSC 負(fù)責(zé)不同組織的三萜類化合物的合成；而有些植物的OSC 具有多重功能，如雷公藤TwOSC1 可以將2,3-氧化鯊烯環(huán)化同時(shí)生成β-香樹脂醇、α-香樹脂醇和木栓酮[10]，紫荊花BfOSC1 可以將2,3-氧化鯊烯環(huán)化同時(shí)生成β-香樹脂醇、α-香樹脂醇和羽扇豆醇[11]。

圖2 五環(huán)三萜類化合物的合成途徑Fig.2 Synthetic pathway of pentacyclic triterpenoids

表1 五環(huán)三萜類化合物生物合成相關(guān)的OSC 信息Table 1 OSC related to biosynthesis of pentacyclic triterpenoids

3 CYP450 對(duì)五環(huán)三萜類化合物的修飾

CYP450 是廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌及真菌等細(xì)胞內(nèi)的血紅素-鐵硫蛋白，由血紅素蛋白、黃素蛋白及磷脂組成，相對(duì)分子質(zhì)量約5×104，具有一個(gè)保守的血紅素結(jié)構(gòu)域。CYP450 家族成員之間的一級(jí)結(jié)構(gòu)差異較大，但空間結(jié)構(gòu)十分相似，均具有由含鐵血紅素和半胱氨酸組成的活性中心，活性中心的鐵離子一側(cè)與半胱氨酸的硫絡(luò)合，另一側(cè)與水中的氧分子絡(luò)合。絕對(duì)保守的半胱氨酸與催化活性中心亞鐵血紅素中鐵元素形成硫醇鹽離子鍵，成為鐵的一個(gè)配體[39]，從而使CYP450 中的鐵能與一氧化碳絡(luò)合，在波長450 nm 處有最大吸收峰，CYP450也由此得名。

目前，已鑒定出約67 種CYP450 可以修飾植物五環(huán)三萜類骨架（表2），其中大多數(shù)屬于CYP716家族成員。其他CYP450 家族CYP51、CYP71、CYP72、CYP87、CYP88 和CYP93 也參與對(duì)五環(huán)三萜的修飾[39]。

表2 五環(huán)三萜化合物生物合成相關(guān)的CYP450s 信息Table 2 CYP450s related to biosynthesis of pentacyclic triterpenoids

續(xù)表2

3.1 CYP716 家族對(duì)五環(huán)三萜類化合物的修飾

大部分植物CYP716 家族可以參與五環(huán)三萜類骨架的修飾。CYP716 家族參與五環(huán)三萜類化合物生物合成的第1 個(gè)證據(jù)來自擬南芥，研究顯示CYP716A1 和CYP716A2 與PEN3(OSC）共表達(dá)[40]。此后，結(jié)合代謝組、轉(zhuǎn)錄組和基因組分析，從植物中鑒定出了其他CYP716A 家族[41-43]。Carelli 等[44]發(fā)現(xiàn)CYP716A12 可以催化β-香樹脂醇C28 位的連續(xù)3 步氧化生成齊墩果酸。之后利用異源體系進(jìn)行體外和體內(nèi)研究，發(fā)現(xiàn)CYP716A12 還可以將α-香樹脂醇和羽扇豆醇C28 位置連續(xù)3 步氧化分別生成熊果酸和樺木酸。大約40 種CYP716A 具有香樹脂醇、羽扇豆醇C28-氧化酶活性。這些CYP716A 大多數(shù)催化香樹脂醇、羽扇豆醇骨架C28 的連續(xù)3 步氧化，分別連續(xù)形成羥基、醛基和羧基。一些植物的CYP716A 也靶向香樹脂醇骨架的其他碳原子，如作用于C22α 羥化的擬南芥CYP716A2，作用于C3 氧化的青蒿CYP716A14v2 和作用于C16β 羥化的青蒿CYP716A111 和桔梗CYP716A141[41,45-46]。

除 CYP716A 亞家族成員外，CYP716C、CYP716E、CYP716S 和CYP716Y 亞家族成員也能夠氧化五環(huán)三萜骨架。積雪草CYP716C11 催化齊墩果酸、6β-羥基齊墩果酸和熊果酸的C2α 羥基化[41]；番茄CYP716E26 和積雪草CYP716E41 具有分別以α-香樹脂醇、β-香樹脂醇和齊墩果酸、熊果酸、山楂酸為底物的C6β-羥化酶活性[41,47]；桔梗CYP716S5則能催化β-香樹脂醇和齊墩果酸的C12-C13α 環(huán)氧化。此外，柴胡CYP716Y1 是一種C16α-羥化酶，它對(duì)β-香樹脂醇和α-香樹脂醇骨架具有修飾作用[41,48]。

3.2 CYP 其他家族對(duì)五環(huán)三萜類化合物的修飾

CYP51H 是專門修飾五環(huán)三萜骨架的亞家族。CYP51H10 催化β-香樹脂醇C 環(huán)C12-C13β-環(huán)氧化和β-香樹脂醇D 環(huán)的C16 位β-羥基化，最終形成12,13β-環(huán)氧-16β-羥基-β-香樹脂醇，即燕麥白蛋白生物合成途徑的中間體[49-50]。CYP72A 亞家族成員也普遍參與五環(huán)三萜類化合物的生物合成，苜蓿和甘草的CYP72As 與豆類特異性五環(huán)三萜類化合物的生物合成有關(guān)。已報(bào)道有 4 種苜蓿 CYP72A（CYP72A61、CYP72A63、CYP72A67 和CYP72A68）和一種甘草CYP72A(CYP72A154)參與齊墩果烷五環(huán)三萜骨架的氧化[51-53]。CYP72A67 和CYP72A68分別屬于C2β-羥化酶（齊墩果酸、常春藤C2β-羥化酶）和C23-氧化酶（齊墩果酸酸、常春藤、2β-羥基常春藤C23-氧化酶）[51,53]。CYP88D6 是與烏拉爾甘草甜素生物合成相關(guān)的酶[54]。CYP88D6 催化β-香樹脂醇C11 位的連續(xù)2 步氧化以產(chǎn)生CYP72A154 的底物11-氧代-β-香樹脂醇。CYP93E 亞家族成員參與豆科植物三萜皂苷的生物合成[55]。大豆CYP93E1 被第1 個(gè)證明屬于C24-羥化酶[56]，它將β-香樹脂醇和槐二醇轉(zhuǎn)化為24-羥基-β-香樹脂醇和大豆皂苷B。迄今為止，8 種豆科物種已鑒定出8 種CYP93E(E2-E9)，它們均具有C24-羥化酶活性。而杉木CYP87D16是目前發(fā)現(xiàn)的與五環(huán)三萜骨架修飾相關(guān)的唯一CYP87D 亞家族成員[57]，CYP87D16 通過催化β-香樹脂醇C16α-羥基化參與五環(huán)三萜類化合物的合成。

4 UGT 對(duì)五環(huán)三萜類化合物的修飾

在五環(huán)三萜類化合物合成過程中，骨架的糖基化是關(guān)鍵的修飾反應(yīng)，該反應(yīng)通過糖基轉(zhuǎn)移酶來實(shí)現(xiàn)。糖基轉(zhuǎn)移酶使糖基和天然產(chǎn)物之間形成特定的糖苷鍵來合成糖苷類化合物，通過糖基化反應(yīng)參與維持細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)。糖基轉(zhuǎn)移酶能夠識(shí)別多種受體，催化活化的糖基從供體分子轉(zhuǎn)移到受體分子上，改變受體分子的化學(xué)穩(wěn)定性、水溶性以及受體分子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力和生物活性等，進(jìn)而有助于提高其生物利用度和生物活性等。

糖基轉(zhuǎn)移酶是高度分化的超級(jí)酶家族，隨著對(duì)其研究的深入，越來越多的糖基轉(zhuǎn)移酶被鑒定出來。截至目前，碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（carbohydrateactive enzyme database，CAZy）中共收錄了高達(dá)736 091 個(gè)不同物種的糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列，包括17 115 個(gè)尚未分類的序列。根據(jù)糖基轉(zhuǎn)移酶序列的相似度、催化底物的特異性和催化產(chǎn)物的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，CAZy 數(shù)據(jù)庫將糖基轉(zhuǎn)移酶分為111 個(gè)家族（GT1～GT111），同一家族成員間的氨基酸序列一致性高于40%，而同一亞家族成員間氨基酸序列一致性高于60%[64]。參與植物次生代謝的糖基轉(zhuǎn)移酶主要分布在GT1 家族。GT1 家族糖基供體為核苷- 2-磷酸糖，其中UGT 的供體分子主要包括UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-鼠李糖和UDP-木糖等[65-67]。

五環(huán)三萜類化合物的糖鏈合成是通過將UDP的糖基轉(zhuǎn)移至皂苷元上的連續(xù)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。目前，在大豆、燕麥、山芥、甘草以及苜蓿等植物中已鑒定出31 種參與植物五環(huán)三萜類化合物后修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶（表3），對(duì)這些已知功能的UGT 利用neighbor-joining 的方法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），發(fā)現(xiàn)這些糖基轉(zhuǎn)移酶主要分布在UGT73、UGT74、UGT91、UGT99 等家族。

4.1 UGT73 家族對(duì)五環(huán)三萜類化合物的修飾

在植物中，大多數(shù)UGT73 家族糖基轉(zhuǎn)移酶被發(fā)現(xiàn)參與五環(huán)三萜類化合物的糖基修飾，負(fù)責(zé)在齊墩果酸、常春藤皂苷等的C3、C23 和C28 位轉(zhuǎn)移糖基。目前，在山芥中找到了10 種參與五環(huán)三萜類化合物糖基修飾的UGT，Augustin 等[68]發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C10 和UGT73C11 可以催化常春藤皂苷和齊墩果酸的C3 位葡萄糖糖基化，UGT73C12 和UGT73C13 可以連續(xù)催化常春藤皂苷以及齊墩果酸的C3 位轉(zhuǎn)移2 個(gè)葡萄糖基生成3-O-葡萄糖-葡萄糖-常春藤皂苷和3-O-葡萄糖-葡萄糖-齊墩果酸。在其他植物中，Naoumkina 等[71]用全面的基因表達(dá)聚類分析鑒定得出苜蓿糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73F3 可以催化常春藤皂苷以及齊墩果酸的C28 位羧基的葡萄糖基化。另外，Achnine 等[70]通過對(duì)苜蓿轉(zhuǎn)錄譜和代謝譜的整合分析確認(rèn)苜蓿中的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73K1可以分別催化常春藤皂苷C3、C28 位2 個(gè)不同位置的葡萄糖糖基化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)UGT73K1 可以催化大豆皂苷C3、C22 和C23 位的葡萄糖糖基化。Shibuya等[76]通過比對(duì)大豆和蒺藜苜蓿的表達(dá)序列標(biāo)簽信

息，成功鑒定出大豆中參與大豆皂苷I生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73P2，體外酶活分析顯示UGT73P2從UDP-半乳糖中轉(zhuǎn)移1 個(gè)半乳糖基至大豆皂苷B單葡糖醛酸苷上從而合成大豆皂苷Ⅲ。Sayama 等[80]發(fā)現(xiàn)大豆糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73F4 和UGT73F2 依次從UDP-木糖基和UDP-葡萄糖基中轉(zhuǎn)移糖基至大豆皂苷A 的C22 位生成22-O-木糖-葡萄糖-大豆皂苷A。

表3 五環(huán)三萜類化合物合成相關(guān)UGTs 信息Table 3 Summary of UGTs related to the synthesis of pentacyclic triterpenoids

在UGT73 家族中，存在一類特異識(shí)別UDP-葡糖醛酸基的UGT，如Tang 等[79]從姜狀三七以及竹節(jié)參中發(fā)現(xiàn)了PzGAT1、PzGAT2、PzGAT3、PjGAT1 4 個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，它們具有相同的功能，可以催化齊墩果酸的C3 位葡萄糖醛酸化。其中，姜狀三七中發(fā)現(xiàn)的3 個(gè)葡萄糖醛酸基糖基轉(zhuǎn)移酶均屬于UGT73 家族，并且相互之間序列差異較小，同在姜狀三七根部特異表達(dá)。Nomura 等[73]發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73P12 通過將UDP-葡糖醛酸的葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移至3-O-葡萄糖酸-甘草次酸的C3-2 位來生產(chǎn)甘草酸苷。此外，Xu 等[72]發(fā)現(xiàn)了甘草中與香樹脂醇合酶協(xié)同表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶GuUGAT，體外驗(yàn)證GuUGAT 可以連續(xù)催化甘草次酸的C3-1 和C3-2 位添加葡萄糖醛酸基，最終生成甘草酸苷。

目前只在積雪草中發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)參與烏蘇烷型皂苷糖基修飾的UGT，均屬于UGT73 家族。de Costa等[78]發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶CaUGT73AD1 可以將積雪草酸和羥基積雪草酸的C28 羧基部分葡萄糖基化。此外，Kim 等[77]通過茉莉酸甲酯處理積雪草葉片后轉(zhuǎn)錄組測序分析到6 個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)顯著上調(diào)，其中糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73AH1 可以催化五環(huán)三萜類化合物的糖基化，負(fù)責(zé)積雪草酸的C28 位葡萄糖基糖基轉(zhuǎn)移。

4.2 其他糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)五環(huán)三萜類化合物的修飾

除了UGT73 家族，其他家族的UGT 也被報(bào)道參與五環(huán)三萜類化合物的糖基修飾，如Meesapyodsuk等[23]從石竹科王不留行發(fā)育種子的表達(dá)序列標(biāo)簽中發(fā)現(xiàn)了 1 個(gè)五環(huán)三萜羧酸葡糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74M1，可以從UDP-葡萄糖基中轉(zhuǎn)移1 個(gè)葡萄糖基至絲石竹酸C28 位的羧基生成28-O-葡萄糖-絲石竹酸。Shibuya 等[76]發(fā)現(xiàn)GmSGT3（UGT91H4）可以從UDP-鼠李糖中轉(zhuǎn)移鼠李糖基到大豆皂苷Ⅲ的C3-3 位生成大豆皂苷I。Achnine 等[70]利用茉莉酸甲酯處理蒺藜苜蓿，結(jié)合轉(zhuǎn)錄譜、代謝譜和體外功能分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶UGT71G1 不僅可以催化五環(huán)三萜類化合物，催化苜蓿酸和常春藤皂苷C3 位的葡萄糖基糖基化，也可以黃酮類化合物為底物進(jìn)行糖基修飾，將槲皮素糖基化為多種槲皮素葡萄糖苷。Louveau 等[82]結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，在燕麥中找到了催化12,13β-環(huán)氧，16β-羥基-β-香樹脂醇的C3-1 位阿拉伯糖糖基轉(zhuǎn)移酶AsAAT1。而后，Orme 等[81]發(fā)現(xiàn)在燕麥的基因簇上同時(shí)存在1個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶AsUGT91G16 和1 個(gè)糖苷酶AsTG1，他們共同參與了燕麥皂苷的合成，依次在12,13β-環(huán)氧，16β-羥基-β-香樹脂醇的C3-2、C3-3 位添加2 個(gè)葡萄糖基生成下游燕麥根皂苷合成的前體物質(zhì)。值得注意的是AsTG1 并不是UGT 家族成員，而是屬于GH1 的糖苷酶，與GT 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3），是目前在植物中首次發(fā)現(xiàn)具有萜類化合物糖基轉(zhuǎn)移酶活性的糖苷酶。除此之外，亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶AsUGT91G16 定位在細(xì)胞質(zhì)中，而糖苷酶AsTG1定位在液泡中，說明萜類化合物可以在細(xì)胞器之間運(yùn)輸和合成。

4.3 糖基轉(zhuǎn)移酶的特異活性位點(diǎn)

根據(jù)糖基轉(zhuǎn)移酶三維結(jié)構(gòu)的折疊特征，可以將其分為GT-A、GT-B、GT-C 和GT-D 4 種類型。目前已經(jīng)解析的植物糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)均屬于GT-B折疊方式，含有2 個(gè)羅斯曼折疊的β/α/β 結(jié)構(gòu)域。目前一共有13 個(gè)植物GT 的結(jié)構(gòu)被解析出來，其中MtUGT71G1（PDB ID∶2ACV）[83]是同時(shí)作用于五環(huán)三萜類化合物和黃酮化合物的糖基轉(zhuǎn)移酶，其晶體結(jié)構(gòu)常被用于參與萜類化合物糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測（圖4-A）。

晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)MtUGT71G1 的N 端結(jié)構(gòu)域和C 端結(jié)構(gòu)域之間形成一條細(xì)長的縫隙，其中N 端結(jié)構(gòu)域的保守性較差，主要參與結(jié)合糖基受體，但是參與糖基化催化反應(yīng)的重要氨基酸位點(diǎn)（His22組氨酸和Asp121 天冬氨酸）是高度保守的，分別定點(diǎn)突變His22 和Asp121，糖基轉(zhuǎn)移酶活性完全喪失[84]。糖基供體通過與植物GTC 端結(jié)構(gòu)域PSPG（putative secondary plant glycosyltransferase）區(qū)域的氨基酸殘基之間的多個(gè)氫鍵相互作用，從而與糖基轉(zhuǎn)移酶穩(wěn)定地結(jié)合。PSPG 無論在長度還是氨基酸序列上都高度保守（圖4-C），保守的PSPG 結(jié)構(gòu)單元與糖基供體進(jìn)行主要的相互作用，構(gòu)成結(jié)合口袋的一面。植物糖基轉(zhuǎn)移酶PSPG 的44 個(gè)氨基酸殘基中，至少10 個(gè)高度保守氨基酸殘基與UDP-糖發(fā)生直接相互作用，與糖部分形成氫鍵[85]。如MTUGT71G1 結(jié)構(gòu)中參與供體分子接觸的氨基酸殘基Trp339、Gln342、 His357 和Glu365 在植物UGTs 一級(jí)序列中保守存在。Gln382 在葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶中保守，而相對(duì)的His382 在半乳糖糖基轉(zhuǎn)移酶中保守。Glu381 和Gln382 這2 個(gè)位點(diǎn)被推測對(duì)于糖基專一性至關(guān)重要，Glu381 在有的蛋白中被天冬氨酸所代替。Trp360、Glu381 和Gln382 這3 個(gè)殘基與糖形成氫鍵保守存在（圖4-B、C）[83]，位于糖基供體結(jié)合中心的相對(duì)保守的蘇氨酸Thr143 被認(rèn)為在糖基供體識(shí)別過程中發(fā)揮非常重要的作用[86]。

圖3 參與五環(huán)三萜化合物生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)化分析Fig.3 Evolutionary analysis of glycosyltransferase involved in biosynthesis of pentacyclic triterpenoids

具有阿拉伯糖糖基轉(zhuǎn)移酶活性的AsAAT1 具有1 個(gè)關(guān)鍵的保守組氨酸殘基，用于特異性的識(shí)別糖供體，位于PSPG 區(qū)域的末端。該組氨酸H404 和P154 的突變將AsAAT1 從阿拉伯糖糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶[82]。此外，Arg32 被認(rèn)為是甘草糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73P12 的必需氨基酸殘基，它對(duì)UDP-葡萄糖醛酸具有高度特異的催化能力。Arg32 突變?yōu)镾er32，UGT73P12 會(huì)失去對(duì)葡萄糖醛酸的高特異性，并獲得對(duì)UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的高選擇性。His29 或Asp131 突變，則會(huì)導(dǎo)致UGT73P12 蛋白失活[73]。

確定植物UGTs 的糖基供體專一性、受體專一性以及UGTs 催化活性是非常復(fù)雜的過程，為了更精確的理解這一過程，解析UDP-葡萄糖以外的糖基供體分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)會(huì)很有幫助。

5 結(jié)語與展望

五環(huán)三萜類化合物結(jié)構(gòu)多樣，涉及修飾酶基因種類繁多，目前對(duì)其合成途徑的了解還不夠深入，仍需對(duì)五環(huán)三萜骨架后修飾階段進(jìn)行研究。4 種類型的五環(huán)三萜類化合物骨架的生物合成途徑已經(jīng)比較完善，但對(duì)羽扇豆烷型和木栓烷型皂苷元氧化、羥化等修飾的具體機(jī)制了解還知之甚少。糖基轉(zhuǎn)移酶參與糖基修飾時(shí)對(duì)于位點(diǎn)識(shí)別特異性較強(qiáng)，因此，已知糖基轉(zhuǎn)移酶的鑒定和催化機(jī)制的研究將會(huì)有助于對(duì)植物中未知糖基轉(zhuǎn)移酶的挖掘。

圖4 UGT 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)及活性位點(diǎn)分析Fig.4 Analysis of three-dimensional structure and active sites of UGT protein

五環(huán)三萜類化合物因其優(yōu)越的藥理活性逐步進(jìn)入人們的生活，但由于植物中五環(huán)三萜類化合物的含量較少，提取步驟復(fù)雜，植物資源稀缺，急需開發(fā)可以高效合成五環(huán)三萜類化合物的方法。隨著研 究者們對(duì)植物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑研究的深入，以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)和大規(guī)模發(fā)酵工藝的快速發(fā)展、優(yōu)化，構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法來大量合成植物五環(huán)三萜類化合物。目前，對(duì)五環(huán)三萜類化合物異源生物合成已有少量的研究。Liu 等[87]將β-香樹脂醇合酶轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，通過增加乙酰輔酶A 的代謝通量，提高β-香樹脂醇的合成量達(dá)到279.0 mg/L；Arendt 等[88]在釀酒酵母中異源合成了齊墩果酸、苜蓿酸、貝萼皂苷、常春藤皂苷、羽扇豆醇和白樺酸等多種五環(huán)三萜類化合物，并發(fā)現(xiàn)磷脂酸磷酸酶的缺失會(huì)導(dǎo)致酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜面積增加，從而促進(jìn)五環(huán)三萜類化合物及其糖基化產(chǎn)物的生成。

盡管已有一些成功異源合成五環(huán)三萜類化合物的例子，但目前的技術(shù)仍未達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)級(jí)別。構(gòu)建高產(chǎn)量的微生物細(xì)胞工程合成五環(huán)三萜類化合物還存在幾個(gè)主要限制因素：（1）大部分植物五環(huán)三萜類化合物的合成途徑尚未解析；（2）部分植物來源的酶在微生物宿主細(xì)胞中難以表達(dá)，可溶性低；（3）五環(huán)三萜類化合物合成過程中需要消耗大量的輔酶和供體；（4）部分五環(huán)三萜類化合物對(duì)微生物宿主細(xì)胞有毒性。針對(duì)上述問題，快速發(fā)展的代謝組學(xué)和基因組學(xué)分析技術(shù)有助于解決植物代謝途徑解析的問題；酶結(jié)構(gòu)改造以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)工程的應(yīng)用可以提高微生物宿主中植物來源酶的表達(dá)能力和催化活性；通過合成生物學(xué)對(duì)宿主代謝流向優(yōu)化來解決輔酶和供體不足的問題；通過宿主選擇和細(xì)胞器區(qū)域化生產(chǎn)有望解決產(chǎn)物對(duì)宿主產(chǎn)生細(xì)胞毒性的問題。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突