羅茹蓉 張桂蕓 姚文香 雒鈺花 吳梅仙 (白銀市第二人民醫(yī)院婦科，甘肅 白銀 730900)

宮頸癌(CC)是世界上最常見的婦科惡性腫瘤之一，也是女性癌癥相關(guān)死亡率的主要原因〔1〕。在過去幾十年中，隨著CC組織的病理檢查的改善和早期診斷的應(yīng)用，CC的發(fā)病率和死亡率顯著降低，但晚期出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者5年生存率僅5%～15%〔2〕。目前，CC的主要治療方法是手術(shù)、化療和放療，盡管目前人們在治療和預(yù)防方面付出了巨大努力，但患者預(yù)后仍不能令人滿意。因此，充分了解CC的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，對(duì)識(shí)別和篩選CC早期診斷和臨床治療的分子標(biāo)志物具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性小的非編碼RNA，長度18～22個(gè)核苷酸，其與相關(guān)靶mRNA的3′-UTR相互作用，通過直接和間接影響mRNA的轉(zhuǎn)錄過程來調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。近年來，據(jù)報(bào)道m(xù)iRNA在一些參與腫瘤發(fā)生的事件中起重要作用，如細(xì)胞存活、增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移〔3，4〕。研究表明，miR-210在人類不同的腫瘤中發(fā)揮致癌的作用，如結(jié)腸直腸癌、乳腺癌和膀胱癌等〔5～7〕。據(jù)報(bào)道，miR-210能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和骨轉(zhuǎn)移，該過程與核因子(NF)-κB信號(hào)通路密切相關(guān)〔8〕。然而，miR-210在CC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的作用仍然未知。本實(shí)驗(yàn)通過檢測miR-210在CC細(xì)胞中的表達(dá)，探究其對(duì)Hela細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及可能的機(jī)制，以期為CC的早期診斷和靶向治療提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 人正常宮頸上皮細(xì)胞H8和CC細(xì)胞Hela、caski、siha和c4-1均購自美國ATCC細(xì)胞庫；胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基均購自美國HyClone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；miR-210 inhibitor及inhibitor Control購自廣州市銳博生物科技有限公司；TRIzol試劑和Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測定試劑盒和AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡測定試劑盒購自日本TaKaRa公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑和二甲基亞砜均購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Coring公司；細(xì)胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑購自碧云天生物科技研究所；B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)和酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人宮頸癌Hela細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中分別加入終濃度為1×105U/L的青霉素和100 mg/L的鏈霉素，將細(xì)胞放置在含5%CO2、相對(duì)濕度95%、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長密度達(dá)80%以上時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。將對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種到6孔板中，每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞，置培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)50%～60%融合時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑說明書轉(zhuǎn)染miR-210 inhibitor或inhibitor Control，將細(xì)胞分為空白對(duì)照(Control)組、陰性對(duì)照(anti-NC)組和實(shí)驗(yàn)(anti-miR-210)組，各組Hela細(xì)胞置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-210的表達(dá)水平 分別收集處于對(duì)數(shù)生長期的H8、Hela、caski、siha、c4-1細(xì)胞和轉(zhuǎn)染48 h后各組Hela細(xì)胞，TRIzol法提取各細(xì)胞中總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，使用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃ 3 min，94℃ 15 s，56℃ 20 s，72℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用相對(duì)定量2-△△Ct法計(jì)算miR-210相對(duì)表達(dá)水平。

1.4CCK-8法檢測Hela細(xì)胞增殖情況 對(duì)數(shù)期的Hela細(xì)胞接種到96孔板中，細(xì)胞接種密度為5×103個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁生長后按照1.2進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，向每孔細(xì)胞中緩慢加入10 μl CCK-8溶液，避免氣泡產(chǎn)生，在37℃培養(yǎng)箱孵育4 h，使用酶標(biāo)儀測定波長為450 nm處光密度值(OD值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力 Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用不含血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓處理16 h，分別收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，每個(gè)Transwell小室的上室(侵襲實(shí)驗(yàn)Transwell小室的上室預(yù)先用Matrigel膠包被，遷移實(shí)驗(yàn)Transwell小室的上室不以Matrigel膠包被)加入100 μl細(xì)胞懸液，在下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，用90%乙醇固定20 min，用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽擦去上室未穿膜的細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，風(fēng)干，在顯微鏡低倍鏡(×100)下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，并記錄細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 分別收集轉(zhuǎn)染48 h后各組Hela細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，離心收集約1×106個(gè)細(xì)胞，加入結(jié)合緩沖液100 μl重懸細(xì)胞，向細(xì)胞懸液中加入FITC-AnnexinⅤ溶液5 μl，輕輕混勻，孵育15 min，再向細(xì)胞中加入PI染液5 μl，混勻后避光反應(yīng)15 min，使用上流式細(xì)胞儀檢測各組Hela細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7Western印跡檢測蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染48 h后收集各組Hela細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液，置冰上提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測定蛋白樣品濃度，取30 μg蛋白樣品行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在含5%脫脂奶粉的封閉液中封阻1 h，分別加入一抗4℃過夜雜交，Bcl-2一抗(1∶500)，Bax一抗(1∶500)，酶切Caspase-3一抗(1∶500)，IκBα一抗(1∶500)，p-IκBα一抗(1∶500)，NF-κB一抗(1∶500)，p-NF-κB一抗(1∶500)。PBST洗滌3次(每次10 min)，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，室溫雜交2 h。PBST洗滌3次(每次10 min)，以ECL試劑顯影，以β-actin標(biāo)定，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-210在CC細(xì)胞中表達(dá)水平升高 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，Hela細(xì)胞(3.52±0.38)、caski細(xì)胞(2.44±0.25)、siha細(xì)胞(2.59±0.28)和c4-1細(xì)胞中miR-210的表達(dá)水平(1.94±0.20)顯著高于正常宮頸上皮H8細(xì)胞(1.00±0.10，P<0.05)。在Hela細(xì)胞中的表達(dá)水平最高，后續(xù)采用Hela細(xì)胞開展功能實(shí)驗(yàn)。

2.2miR-210 inhibitor轉(zhuǎn)染效率檢測 anti-miR-210組Hela細(xì)胞中miR-210表達(dá)水平(0.31±0.03)明顯低于Control組(1.00±0.11)和anti-NC組(1.00±0.09，P<0.05)。Control組和anti-NC組細(xì)胞中miR-210表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3敲減miR-210抑制Hela細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，anti-miR-210組Hela細(xì)胞OD值明顯低于Control組和anti-NC組(P<0.05)。Control組和anti-NC組細(xì)胞OD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，anti-miR-210組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于Control組和anti-NC組(P<0.05)。Control組和anti-NC組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1和表1。

圖1 敲減miR-210對(duì)Hela細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表1 敲減miR-210對(duì)Hela細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響

2.4敲減miR-210促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，anti-miR-210組Hela細(xì)胞凋亡率明顯高于Control組和anti-NC組(P<0.05)。Control組和anti-NC組細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示，anti-miR-210組Hela細(xì)胞中Bax和酶切Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯高于Control組和anti-NC組(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯低于Control組和anti-NC組(P<0.05)。Control組和anti-NC組細(xì)胞中Bcl-2、Bax和酶切Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2，表2和圖3。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組Hela細(xì)胞凋亡率

組別凋亡率(%)Bcl-2Bax酶切Caspase-3Control組5.31±0.680.76±0.080.11±0.010.04±0.01anti-NC組5.42±0.660.74±0.070.10±0.010.03±0.01anti-miR-210組19.26±2.111)2)0.30±0.031)2)0.52±0.061)2)0.68±0.071)2)F/P值108.267/0.00049.869/0.000136.026/0.000244.765/0.000

圖3 Western印跡檢測各組Hela細(xì)胞中Bcl-2、Bax和酶切Caspase-3蛋白表達(dá)水平

2.5敲減miR-210抑制NF-κB信號(hào)通路的激活 Western印跡檢測結(jié)果顯示，anti-miR-210組Hela細(xì)胞中p-IκBα和p-NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯低于Control組和anti-NC組(P<0.05)，IκBα和NF-κB蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)；Control組和anti-NC組細(xì)胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4和表3。

圖4 Western印跡檢測各組Hela細(xì)胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB蛋白水平

表3 各組Hela細(xì)胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB蛋白水平比較

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA表達(dá)異常不僅能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞無限增殖還可影響細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移〔9，10〕。因此，深入探究miRNA的生物學(xué)功能為惡性腫瘤的早期診斷和靶向治療提供新的方向。以往研究顯示，miR-210在人類多種腫瘤中呈高表達(dá)，作為致癌基因，miR-210能夠靶向調(diào)控基因表達(dá)或信號(hào)通路的活化。如Liu等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-210在骨肉瘤組織中的表達(dá)顯著高于其配對(duì)正常組織，體外功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-210可通過直接靶向成纖維細(xì)胞生長因子受體樣(FGFRL)1促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲。Luan等〔12〕研究顯示，miR-210通過靶向Bcl-2腺病毒E1B相互作用蛋白(BNIP)3保護(hù)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的損傷，此外該過程涉及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路。陽寧等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-210在前列腺癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，其可通過下調(diào)BNIP3的表達(dá)抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡。并且miR-210的表達(dá)升高與腎癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和預(yù)后不良有關(guān)〔14～16〕。目前研究發(fā)現(xiàn)，miR-210在宮頸癌組織中異常高表達(dá)，然而關(guān)于miR-210在宮頸癌中的功能及作用機(jī)制尚不清楚〔17〕。

有研究指出，miR-210作為致癌基因可通過上調(diào)Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)水平促進(jìn)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的凋亡〔18〕。另一項(xiàng)研究表明，miR-210可通過調(diào)控Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平影響卵巢癌OVCAR3和SKOV3細(xì)胞凋亡〔19〕。本研究結(jié)果顯示，敲減miR-210后細(xì)胞中Bax和酶切Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，這與以往研究一致。提示敲減miR-210可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明，NF-κB信號(hào)通路在人類多種類型的癌癥中異常激活，這與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。例如，在CC中，NF-κB信號(hào)的異常激活與CC的預(yù)后不良密切相關(guān)；抑制NF-κB信號(hào)通路能夠抑制CC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔20～22〕。在靜息的細(xì)胞中，NF-κB和IκB結(jié)合形成復(fù)合體，以無活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受外界刺激后，IκB發(fā)生磷酸化暴露NF-κB核定位位點(diǎn)，NF-κB轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)〔23〕。本研究結(jié)果提示過表達(dá)miR-210可能抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。Zhang等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-210通過靶向死亡受體(DR)6抑制NF-κB信號(hào)通路影響軟骨細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡。結(jié)合Zhang等〔24〕和Ren等〔8〕研究提示miR-210可能通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用。本研究結(jié)果表明miR-210可能通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路影響CC Hela細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移。

總之，本研究結(jié)果表明miR-210在CC細(xì)胞中呈高表達(dá)，敲減CC Hela細(xì)胞中miR-210的表達(dá)能夠通過抑制NF-κB信號(hào)通路的激活抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。提示miR-210可能有望成為CC靶向治療的新靶點(diǎn)。