巨偉，王紅日，薛春芝，龐亞男，吳德豪，郭憲峰，程敦公，韓冉，劉愛(ài)峰，李豪圣，劉建軍，曹新有，宋健民，訾妍

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.山東魯研農(nóng)業(yè)良種有限公司，山東 濟(jì)南 250100；3.菏澤市牡丹區(qū)種子資源開(kāi)發(fā)保護(hù)中心，山東 菏澤 274000）

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是解析生物經(jīng)濟(jì)性狀形成分子機(jī)制、發(fā)掘基因資源的重要手段之一［1］，該技術(shù)為差異基因表達(dá)分析、功能基因和轉(zhuǎn)錄因子挖掘、等位基因特異性表達(dá)研究等提供了新的手段，尤其是對(duì)全面解析復(fù)雜性狀的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常有效，已成功應(yīng)用于水稻、玉米、小麥、黃瓜、黃豆、番茄等多種作物研究。因此，獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組對(duì)于作為重要糧食作物之一的小麥具有重要的研究意義。近年來(lái)，針對(duì)小麥抗旱、耐熱、抗病等性狀進(jìn)行了一些轉(zhuǎn)錄組研究，篩選出部分目的基因，并對(duì)篩選到的基因進(jìn)行了深入分析［2-5］。

小麥?zhǔn)称芳庸て焚|(zhì)是決定其生產(chǎn)應(yīng)用和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的關(guān)鍵因素，小麥品質(zhì)主要受蛋白、淀粉等籽粒主要成分理化特性的控制，而蛋白和淀粉的合成受一系列基因和調(diào)控因子的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，因此利用RNA-Seq技術(shù)構(gòu)建不同面包、面條品質(zhì)類型典型品種籽粒轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，篩選差異表達(dá)基因，發(fā)掘調(diào)控面包、面條品質(zhì)的關(guān)鍵基因和調(diào)控因子，解析小麥品質(zhì)形成的生理代謝機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于指導(dǎo)我國(guó)小麥品質(zhì)遺傳改良具有重要意義。小麥品質(zhì)性狀非常復(fù)雜，過(guò)去研究多局限于單一或個(gè)別性狀的影響和調(diào)控分析，研究方法也多是統(tǒng)計(jì)分析，很少在全基因組水平全面解析小麥品質(zhì)的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。RNA-Seq技術(shù)的發(fā)展，為從轉(zhuǎn)錄組水平全面解析小麥品質(zhì)遺傳調(diào)控提供了可能。Yu等［6］通過(guò)動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定出8個(gè)對(duì)淀粉與蛋白質(zhì)合成以及壓力脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因。利用我們前期研究中篩選出的6類有代表性的小麥材料：面包優(yōu)質(zhì)小麥、面包劣質(zhì)小麥、面條優(yōu)質(zhì)小麥、面條劣質(zhì)小麥、面包和面條兼優(yōu)小麥、面包和面條均劣小麥各2份，本研究利用RNA-Seq技術(shù)分析了其灌漿不同時(shí)期（開(kāi)花后7、17、27 d）的基因表達(dá)情況，以期篩選調(diào)控面包、面條品質(zhì)性狀的差異基因和調(diào)控因子，結(jié)合蛋白和淀粉理化特性篩選關(guān)鍵基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，這對(duì)全面解析小麥品質(zhì)遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、促進(jìn)小麥品質(zhì)遺傳改良具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與種植方法

供試品種為6類12個(gè)小麥品種，分別是面包優(yōu)質(zhì)小麥（GB）JM4072、ZM12，面條優(yōu)質(zhì)小麥（GN）JM19、ZM18，面包劣質(zhì)小麥（BB）TN18、QF1，面條劣質(zhì)小麥（BN）LM1、LM19，面包面條均優(yōu)小麥（GBN）JM20、ZM366，面包面條均劣小麥（BBN）LM14、XM18。

試驗(yàn)于2014—2016年在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)站（36°42′N、117°05′E）進(jìn)行。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，播種密度為3×106株／hm2，行距25 cm，小區(qū)面積6 m2（4.0 m×1.5 m），重復(fù)3次。2014年10月和2015年10月播種，2015年6月和2016年6月收獲，均按高產(chǎn)田常規(guī)栽培措施管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣本采集及RNA提取、純化 分別于花后7、17、27 d取同一天開(kāi)花的小穗中部籽粒，送至廣州基迪奧生物科技有限公司，利用Trizol法提取總RNA，采用DNaseⅠ（RNase-free）消化所得RNA樣本中的殘余DNA。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 樣品提取總RNA后，經(jīng)富集、打斷、六堿基隨機(jī)引物（random hexamers）合成、末端修復(fù)、加堿基A、加測(cè)序接頭、PCR擴(kuò)增等過(guò)程制備測(cè)序文庫(kù)，構(gòu)建好的文庫(kù)用Illumina-HiSeqTM進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 RNA-Seq質(zhì)量評(píng)估和序列比對(duì) 在全部測(cè)序結(jié)果中選擇錯(cuò)誤率小于1%的用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析，更嚴(yán)格過(guò)濾得到high quality clean reads，同時(shí)計(jì)算Q20和Q30。小麥參考基因組從http://www.wheatgenome.org／下載，選取HISAT軟件將過(guò)濾后的測(cè)序序列進(jìn)行基因組定位分析。樣本之間（包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)）的基因表達(dá)水平則采用皮爾遜相關(guān)性檢測(cè)進(jìn)行分析。

1.2.4 差異基因篩選 將同一類型的兩個(gè)品種作為一組，進(jìn)行不同組間小麥品種的差異基因分析?；虮磉_(dá)量的計(jì)算采用FPKM（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped reads）法［7］。使用DESeq R軟件包（1.18.0）［8］對(duì)不同類型小麥之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行研究。當(dāng)FDR校正后的p值＜0.05且時(shí)則認(rèn)為該基因表達(dá)差異顯著。

1.2.5 GO注釋和KEGG分析 Gene Ontology（簡(jiǎn)稱GO，http://www.geneontology.org／）富集分析采用軟件為GOseq［9］，GO分為分子功能（molecular Function）、生物過(guò)程（biological process）和細(xì)胞組成（cellular component）三個(gè)部分。

KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.kegg.jp／）是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息數(shù)據(jù)庫(kù)，分析內(nèi)容包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代謝及有機(jī)物的生物降解［10］。

1.2.6 qRT-PCR驗(yàn)證 為了驗(yàn)證RNA-Seq檢測(cè)出的基因表達(dá)水平是否正確，從RNA-Seq測(cè)序用總RNA中取出1μg用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。使用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列由擎科生物技術(shù)有限公司合成，釆用PAGE純化（表1）。

使用羅氏公司的LightCycler 480Ⅱ進(jìn)行熒光定量PCR。熒光定量PCR反應(yīng)體系10μL包括：2×SYBR Premix Ex TaqⅠ5μL，正向引物與反向引物各0.5μL，cDNA 1μL，ddH2O 3μL。PCR程序?yàn)椋?5℃1 min預(yù)變性；40×（95℃15 s，55℃15 s，72℃15 s）收集熒光信號(hào)；95℃1 s，60℃1 s，95℃1 s，37℃1 s為熔解曲線階段。采用2-ΔΔCt法［11］分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果質(zhì)量評(píng)估

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾去除大量的測(cè)序接頭序列、低質(zhì)量的讀段、序列N的比例大于10%的reads，最終得到2 882 357 526條clean reads，每個(gè)樣本測(cè)序量超過(guò)10 G，達(dá)到文庫(kù)采樣深度的要求。質(zhì)量達(dá)到Q30級(jí)別的堿基占總堿基數(shù)的84%以上（表2）。51%以上的reads可以比對(duì)到參考基因組上，50%以上的reads能夠比對(duì)到唯一轉(zhuǎn)錄本上，2%左右的reads可比對(duì)到多個(gè)轉(zhuǎn)錄本上。且reads打斷隨機(jī)性好，在參考基因組各個(gè)位置分布均勻。比對(duì)到唯一轉(zhuǎn)錄本的reads可以用來(lái)進(jìn)行下一步的分析工作。

表2 RNA-Seq測(cè)序結(jié)果質(zhì)量評(píng)估

2.2 不同類型面包、面條小麥不同時(shí)期差異表達(dá)基因的分析

為了鑒別6類不同加工品質(zhì)小麥的差異表達(dá)基因（DEGs），對(duì)組間基因表達(dá)量進(jìn)行了比對(duì)分析。以同期GB小麥為對(duì)照，花后7 d共找到4 529個(gè)差異表達(dá)基因，其中有2 549、1 980個(gè)基因表達(dá)量分別呈上調(diào)和下調(diào)；花后17 d共找到3 198個(gè)差異表達(dá)基因，其中有1 775、1 423個(gè)基因表達(dá)量分別呈上調(diào)和下調(diào)；花后27 d共找到2 955個(gè)差異表達(dá)基因，其中，1 731、1 224個(gè)基因表達(dá)量分別呈上調(diào)和下調(diào)（圖1）。6類品種在花后7 d差異表達(dá)基因最多，其次是花后17 d，花后27 d最少，這可能是因?yàn)楣酀{前期籽粒膨大生長(zhǎng)階段差異基因較多。

圖1 不同類型小麥組間差異表達(dá)基因的維恩圖

2.3 差異表達(dá)基因的篩選及GO注釋和KEGG分析

發(fā)現(xiàn)花后7、17、27 d分別有1 743、1 195、981個(gè)DEGs在優(yōu)質(zhì)小麥（GN與GBN）中上調(diào)，在劣質(zhì)小麥（BB、BN與BBN）中下調(diào)，對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO功能分類分析發(fā)現(xiàn)，三個(gè)時(shí)期差異基因均主要分布在生物過(guò)程（biological process）的metabolic process和cellular process、細(xì)胞成分（cell component）的cell和cell part以及分子功能（molecular function）的binding和catalytic activity中。

利用KEGG分析研究了與品質(zhì)相關(guān)的生物代謝通路。發(fā)現(xiàn)花后7 d篩選出的1 743個(gè)DEGs被富集到103條通路中，包括DNA及RNA的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、碳循環(huán)、氮代謝、氨基酸代謝、淀粉及糖代謝等，富集DEGs數(shù)目最多的代謝通路有：protein processing in endoplasmic reticulum（36）、starch and sucrose metabolism（22）、spliceosome（20）、plant-pathogen interaction（18）、RNA transport（17）（圖2A）?；ê?7 d篩選出的1 195個(gè)DEGs被富集到98條通路中，包括DNA及RNA的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸的生物合成、碳循環(huán)等，富集DEGs數(shù)目最多的代謝通路有：RNA transport（15）、spliceosome（12）、biosynthesis of amino acids（12）、plant-pathogen interaction（12）（圖2B）?；ê?7 d篩選出的981個(gè)DEGs被富集到89條通路中，包括DNA及RNA的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成、淀粉及糖代謝等，富集DEGs數(shù)目最多的代謝通路有：RNA transport（14）、protein processing in endoplasmic reticulum（10）、spliceosome（9）、biosynthesis of amino acids（9）、starch and sucrose metabolism（9）（圖2C）。

2.4 蔗糖與淀粉代謝通路有關(guān)的差異基因分析

對(duì)蔗糖與淀粉代謝通路進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在以GB為對(duì)照的條件下，花后7、17 d及27 d BB與GB、BBN與GB間淀粉合成通路中差異表達(dá)基因最多?；ê? d，相較于GB小麥，其他類型小麥下調(diào)差異基因較多，花后17 d與花后27 d，BB小麥與GN小麥均為上調(diào)基因較多，其他類型為下調(diào)基因較多（表3）。

圖2 花后7 d（A）、17 d（B）及27 d（C）差異表達(dá)基因KEGG富集分析

對(duì)淀粉與蔗糖代謝通路的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，以GB小麥為對(duì)照，從花后7 d的BB、GN、BN、GBN、BBN品種中分別篩選到14、5、8、6和12個(gè)差異表達(dá)基因，從花后17 d的BB、GN、BN、GBN、BBN品種中分別篩選到14、4、6、4和4個(gè)差異表達(dá)基因，從花后27 d的BB、GN、BN、GBN、BBN品種中分別篩選到7、4、7、4和5個(gè)差異表達(dá)基因，主要涉及糖代謝過(guò)程中的蔗糖合成酶（sucrose synthase，SuS，EC2.4.1.13）和轉(zhuǎn)化酶（invertase，INV，EC3.2.1.26）、蔗糖磷酸酯酶（sucrose phosphatase，SPP）、蔗糖磷酸合酶（sucrosephosphate synthase，SPS），淀粉代謝過(guò)程中的去分支酶（debranching enzyme，DBE）、α-淀粉酶（alpha-amylase，EC3.2.1.1）和 β-淀粉酶（beta-amylase，EC3.2.1.2）。

SPS基因花后7 d在BN小麥中上調(diào)，花后17 d在BB小麥中下調(diào)，花后27 d在GN、BN與BBN小麥中均上調(diào)。相反，SuS在花后7 d的BB、BN小麥中上調(diào)，在GN與BBN中下調(diào)，花后17 d的BB、GN、BN以及BBN小麥中均上調(diào)，花后27 d的BB小麥中上調(diào)；INV在花后7 d的BB、BN與GBN中均下調(diào)，花后17 d在BB、BN和GBN小麥中均下調(diào)，花后27 d在BB、GN、GBN、BBN小麥中均下調(diào)（表4—表6）。推測(cè)花后7 d GN小麥、GBN及BBN小麥蔗糖分解能力較弱；花后17 d GN小麥及BBN小麥蔗糖分解能力高于GB小麥；花后27 d GN、BN與BBN小麥的蔗糖合成能力高于GB小麥。

6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（glucose-6-phosphate isomerase，GPI，EC5.3.1.9）基因在花后7、17、27 d的BB小麥中均上調(diào)。DBE基因在花后不同時(shí)期其他5類小麥中均上調(diào)，推測(cè)與成熟期GB小麥總淀粉含量最低一致。α-淀粉酶和β-淀粉酶基因在花后7 d的BB小麥中下調(diào)，但花后17 d BB小麥中的α-淀粉酶上調(diào)，可以進(jìn)一步推測(cè)是成熟期支鏈淀粉含量低于GB小麥的原因之一。

表3 不同時(shí)期不同類型DEGs及與淀粉合成相關(guān)的DEGs匯總

表4 花后7 d與蔗糖和淀粉代謝通路相關(guān)的DEGs

表5 花后17 d與蔗糖和淀粉代謝通路相關(guān)的DEGs

表6 花后27 d與蔗糖和淀粉代謝通路相關(guān)的DEGs

2.5 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的真實(shí)性，從淀粉合成通路中隨機(jī)挑選了7個(gè)候選基因（Traes＿7BL＿11C5C7BC4、Traes＿7AS＿7D1CD8641、Traes＿3B＿55B913FD2、Traes＿6BL＿C22DEC10D、Traes＿2AL＿0C8275227、Traes＿6BL＿FC54B7E8F和Traes＿7DS＿E488AA1F2）進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證（圖3、4、5）。將驗(yàn)證結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，兩者的相關(guān)系數(shù)較高且表達(dá)趨勢(shì)基本相同，表明RNA-Seq的分析結(jié)果可靠。

圖5 qRT-PCR驗(yàn)證花后27 d RNA-Seq結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本研究采用RNA-Seq技術(shù)分析不同面包、面條品質(zhì)類型小麥在花后7、17、27 d的差異表達(dá)基因。以相同時(shí)期面包優(yōu)質(zhì)小麥為對(duì)照，分別發(fā)現(xiàn)4 529、3 198、2 955個(gè)差異表達(dá)基因。通過(guò)對(duì)不同加工品質(zhì)小麥差異表達(dá)基因的GO富集分析，發(fā)現(xiàn)不同類型小麥在淀粉代謝通路中的差異表達(dá)基因及其參與的生物過(guò)程以及本身的分子功能。與面包優(yōu)質(zhì)小麥進(jìn)行比較，不同類型小麥在花后不同時(shí)期差異表達(dá)的基因主要參與代謝過(guò)程、細(xì)胞生理過(guò)程、細(xì)胞、細(xì)胞組分、結(jié)合功能以及催化活性。對(duì)不同類型小麥的KEGG通路注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同類型小麥之間的差異表達(dá)基因在蛋白質(zhì)合成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工過(guò)程通路、淀粉和蔗糖代謝通路、剪接體通路、RNA轉(zhuǎn)錄通路、氨基酸合成通路以及核糖體通路等通路富集較多。

淀粉與蔗糖代謝在植物發(fā)育、抗逆反應(yīng)等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。小麥淀粉含量及特性對(duì)小麥品質(zhì)特別是面條品質(zhì)影響較大，培育面包面條兼優(yōu)小麥的其中一個(gè)思路即為在面包優(yōu)質(zhì)小麥的基礎(chǔ)上提高面條品質(zhì)。因此，我們重點(diǎn)對(duì)淀粉與蔗糖代謝通路進(jìn)行分析。對(duì)淀粉與蔗糖代謝通路的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，以面包優(yōu)質(zhì)小麥為對(duì)照，從花后7、17、27 d的面包劣質(zhì)、面條優(yōu)質(zhì)、面條劣質(zhì)、包條兼優(yōu)以及包條均劣品種分別篩選到一些差異表達(dá)基因，主要涉及糖代謝過(guò)程中的蔗糖合成酶（SuS）和轉(zhuǎn)化酶（INV）、蔗糖磷酸酯酶（SPP）、蔗糖磷酸合酶（SPS），淀粉代謝過(guò)程中的去分支酶（DBE）、α-淀粉酶和β-淀粉酶。在蔗糖代謝方面，蔗糖在蔗糖合酶和轉(zhuǎn)化酶調(diào)控下參與淀粉的合成［12］，蔗糖磷酸酯酶和蔗糖磷酸合酶在蔗糖合成中起關(guān)鍵作用［13，14］。INV對(duì)蔗糖的水解作用是單向的，而SuS能可逆地催化蔗糖代謝，通常認(rèn)為SuS主要起水解蔗糖的作用。SPS在碳水化合作物代謝方面發(fā)揮重要作用，可以調(diào)控碳在淀粉合成和碳水化合物積累間的分配［15］。

催化6-磷酸果糖和6-磷酸葡萄糖相互轉(zhuǎn)化的6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（GPI）［16］基因在花后7、17、27 d的BB小麥中均上調(diào)，而6-磷酸葡萄糖是合成ADPG的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［17］，因此推測(cè)BB籽粒中ADPG的合成能力高于GB小麥，這與BB小麥具有最高的總淀粉及直鏈淀粉含量相符合。α-淀粉酶與β-淀粉酶是淀粉水解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其中α-淀粉酶可以水解淀粉內(nèi)部的α-1，4-糖苷鍵，β-淀粉酶能將直鏈淀粉分解為麥芽糖；淀粉脫支酶（DBE）專一水解α-1，6-糖苷鍵，支鏈淀粉經(jīng)淀粉酶水解產(chǎn)生的極限糊精，由脫支酶水解去除α-1，6-糖苷鍵，再在α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用下徹底水解［18］。

不同品質(zhì)類型小麥籽粒中蔗糖代謝形成淀粉合成前體的相關(guān)酶類（SPS、INV、SuS）以及淀粉代謝相關(guān)酶類（DBE、α-淀粉酶與β-淀粉酶）存在差異，是總淀粉含量及其組分的差異原因之一。面包劣質(zhì)小麥籽粒淀粉含量及直鏈淀粉含量均高于面包優(yōu)質(zhì)小麥，可能是由于其6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因的高表達(dá)導(dǎo)致。其他5類小麥品種中DBE與α-淀粉酶基因均高于面包優(yōu)質(zhì)小麥，可能是面包優(yōu)質(zhì)小麥總淀粉含量較低、支鏈淀粉含量較高的原因。因此調(diào)控籽粒蔗糖代謝通路以及淀粉水解通路可以作為調(diào)控小麥加工品質(zhì)的新思路。