韓 君,張曉東

(內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010000)

煙酰胺稱為3-吡啶甲酸，煙酸又稱3-吡啶-甲酸。煙酰胺與煙酸統(tǒng)稱為維生素PP,是人體必需的13種維生素之一。煙酰胺在酸或堿的條件下，可轉(zhuǎn)化為煙酸。

1 材料與方法

Waters e 2695高效液相色譜儀；工作站：Empower；乙腈：色譜純，SIGMA-ALDRICH； 純凈水：自制；磷酸二氫鉀：分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三乙胺：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

煙酸 (批號(hào)100434-201102 純度：99.9%)中國(guó)食品藥品檢定研究院

煙酰胺(批號(hào)100115-201204 純度：99.9%)中國(guó)食品藥品檢定研究院

復(fù)合維生素B片(批號(hào)1603004)天津力生制藥股份有限公司

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

儀器：Waters 2695e高效液相色譜儀

色譜柱：Inertsil ODS2 C18 5μm 4.6×250mm

流動(dòng)相：A 0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.5)；B：乙腈

流速：0.8mL/min 檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm 進(jìn)樣量：20μL

按下表洗脫：

時(shí)間(分鐘)流動(dòng)相A(%)流動(dòng)相B(%)0.0115.0015.1040.0040.1060.0099992020999911808011

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取煙酸對(duì)照品17mg，置50mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1mL，置100mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL約含3.4μg的溶液。

2.3 供試品溶液制備

取供試品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于煙酰胺34mg)，置50mL量瓶中，加水振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密稱取煙酸對(duì)照品適量，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL約含0.68mg的溶液，精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品溶液的色譜圖中如有與煙酸保留時(shí)間一致的色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

3 結(jié)果

3.1 破壞實(shí)驗(yàn)

酸破壞試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液(取煙酰胺對(duì)照品34mg,按測(cè)定法供試品溶液配制)10mL,加1mol/L鹽酸溶液0.5mL，避光放置1h，用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，用0.45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按煙酸項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

堿破壞試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液(取煙酰胺對(duì)照品34mg,按測(cè)定法供試品溶液配制)10mL,加1mol/L氫氧化鈉溶液0.5mL，避光放置1h，用1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，用0.45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按煙酸雜質(zhì)項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

氧化破壞試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液(取煙酰胺對(duì)照品34mg,按測(cè)定法供試品溶液配制)10mL,加30%雙氧水溶液3滴，避光放置1h，用0.45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按煙酸雜質(zhì)項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

熱破壞試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液(取煙酰胺對(duì)照品34mg,按測(cè)定法中供試品溶液配制)10mL,置70℃水浴加熱2h，用0.45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按煙酸雜質(zhì)項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

光破壞試驗(yàn)：取原料藥供試品粉末，置紫外燈(UV254nm)下照射24h，取粉末34mg,精密稱定，照供試品溶液配制，按煙酸雜質(zhì)項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

小結(jié)：通過(guò)母液與各個(gè)破壞后的供試品溶液比較，可知，強(qiáng)堿，強(qiáng)氧化條件下可明顯增大破壞原有的煙酰胺主峰，從而產(chǎn)生煙酸；且經(jīng)上述破壞后，主峰和雜質(zhì)峰均能很好分離，說(shuō)明該色譜條件可行。

3.2 陰性空白試驗(yàn)

取不含煙酰胺的陰性空白進(jìn)行檢測(cè)，依照廠家提供處方量(輔料及處方由天津力生制藥股份有限公司提供)，分別稱取維生素B1 0.3g、維生素B2 0.15g、煙酰胺 1g、維生素B6 0.02g、淀粉3.08g、糊精0.96g、磷酸氫鈣2g、95%乙醇0.9g、羥甲基淀粉鈉0.3g和硬脂酸鎂0.06g于研缽中，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于供試品3.4片量)，于50mL量瓶中，加流動(dòng)相35mL，按供試品溶液制備方法處理，取濾液待測(cè)。在被檢測(cè)成分的出峰時(shí)間內(nèi)對(duì)測(cè)定不存在干擾。

3.3 檢出限與定量限測(cè)定結(jié)果

以信噪比(S/N)=3時(shí)為檢出限，以(S/N)=10為定量限，測(cè)得煙酸的檢出限及定量限為0.2ng/mL和0.5ng/mL。

3.4 線性與范圍

精密稱取煙酸對(duì)照品(批號(hào)：100434-201102)17mg，置50mL量瓶中，加水適量，按煙酸測(cè)定項(xiàng)下同法處理。精密量取上述對(duì)照品溶液3μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL注入色譜儀，記錄色譜圖；以濃度為橫坐標(biāo)(μg/mL),以相對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(A)，進(jìn)行線性回歸。煙酸線性方程為：Y=34308-778.92(n=7 r=0.9996)。結(jié)果表明煙酸在0～4.3μg/mL濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.5 精密度試驗(yàn)

照煙酸測(cè)定項(xiàng)下同法處理煙酸對(duì)照品溶液(批號(hào)：100434-201102)1份，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，煙酸峰面積精密度RSD小于2%，說(shuō)明儀器精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

照煙酸測(cè)定項(xiàng)下同法處理對(duì)照品溶液(批號(hào)：100434-201102)一份，分別于0h、6h、12h、24h、36h、48h進(jìn)行測(cè)定，煙酸峰面積精密度RSD小于2%，結(jié)果表明煙酸在48小時(shí)內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

3.7 耐用性試驗(yàn)

其他色譜條件不變，改變流速為0.7mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min；改變流動(dòng)相pH值分別為6.3、6.5、6.8；改變柱溫：20℃、30℃、35℃；改變色譜柱型號(hào)為UITimatexb-C18(5μm 4.6×250mm)、Kromasil (5μm 4.6×250mm)、CAPCELL PAK MG(4.6mm×150mm,5μm)。依法測(cè)定，結(jié)果顯示，各雜質(zhì)峰保留時(shí)間有所改變，但分離度良好，說(shuō)明該方法耐用性良好。

3.8 樣品測(cè)定

取13個(gè)廠家的煙酰胺原料藥、每個(gè)廠家各3批共計(jì)39批復(fù)合維生素B片，各精密稱取適量(約相當(dāng)于煙酰胺34mg)，照供試品溶液處理，取煙酸對(duì)照品按對(duì)照品溶液處理，按擬定的色譜條件與測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定,13批原料藥中7批可檢出煙酸，39批制劑均能檢出煙酸。

表1 13個(gè)廠家復(fù)合維生素B片煙酸的檢測(cè)結(jié)果

4 討論

4.1 TLC法與HPLC法雜質(zhì)檢出結(jié)果的比較

因受檢出限的限制，供試品中均未檢出煙酸及其他雜質(zhì)，未能有效考察樣品間雜質(zhì)差異，對(duì)樣品的內(nèi)在質(zhì)量控制不利。采用新建的HPLC法均能檢出煙酸，能高效、快捷地區(qū)分樣品間雜質(zhì)量的差異并進(jìn)行定量。