李曉花 李禎 臺(tái)海川

【摘 要】 目的：研究7種傣藥材不同極性溶劑提取物對(duì)大腸桿菌（Ec.）和綠膿假單胞菌（Pa.）的抑菌作用。方法：以乙酸乙酯、正丁醇依次萃取7種傣藥材的95%乙醇提取物，獲得不同極性部位;采用濾紙片法測(cè)定提取物的抑菌圈，二倍稀釋法測(cè)定提取物及陽(yáng)性藥物的最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），確定其抑菌活性。結(jié)果：25mg/mL濃度條件下，7種傣藥材不同極性提取物均顯示有不同程度抑菌效果，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈為（1.21±0.04）～（2.80±0.07）cm，對(duì)綠膿假單胞菌的抑菌圈為（0.84±0.03）～（1.96±0.03）cm。其中勐臘大解藥（平脈藤）乙酸乙酯萃取物（MLDJY-2）抑菌效果顯著，對(duì)Ec.抑菌圈、MIC和MBC分別為（2.80±0.07）cm、0.195mg/mL和1.563mg/mL，對(duì)Pa.抑菌圈、MIC和MBC分別為（1.96±0.03）cm、0.781mg/mL和6.250mg/mL。結(jié)論：驗(yàn)證了7種臨床常用傣藥材抗菌活性，為臨床應(yīng)用和抑菌產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 傣藥材;提取物;抑菌圈;最小抑菌濃度;最低殺菌濃度

Abstract：Objective To study the antibacterial effects of different extracts of 7 kinds from Dai medicinal materials against E.coli（EC.） and Pseudomonas aeruginosa （Pa.）. Methods The 95% ethanol extracts of 7 kinds of Dai medicinal materials were extracted with ethyl acetate and n-butanol to obtain different polar fractions. The antibacterial zones were determined by filter paper method， and the minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） of the extracts and positive drug were determined by double dilution method. Results At the concentration of 25g/mL， the inhibitory zones againstE.C. And Pa. were from 1.21±0.04cm to 2.80±0.07cm and 0.84±0.03cm～1.96±0.03cm， respectively. Among them， the MLDJY-2 showed significant antibacterial activity. Inhibition zone agaist E.C.， MIC and MBC were 2.80±0.07cm， 0.195mg/mL and 1.563mg/mL， respectively. antibacterial zone against Pa.，MIC and MBC were 1.96±0.03cm， 0.781mg/mL and 6.250mg/mL， respectively. Conclusion The antibacterial activities of 7 kinds of Dai medicinal materials were verified， which provided scientific basis for clinical application and development of antibacterial chemical products.

Keywords：Dai Medicines; Extracts; Antibacterial Zones; MIC; MBC

感染性疾病是由病毒、衣原體、支原體、立克次體、細(xì)菌、螺旋體、真菌、寄生蟲(chóng)等致病微生物侵入人體導(dǎo)致的疾病，是危害人類健康的主要疾病[1]，臨床常用抗生素治療感染性疾病，具有殺菌抑菌和抗炎效果，但其毒性及濫用引起的二次感染及細(xì)菌的耐藥性等問(wèn)題已經(jīng)成為全球性問(wèn)題[2-3]。中藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)發(fā)展的結(jié)晶，已經(jīng)有多種中藥臨床用于感染性疾病的治療，效果顯著。中藥治療感染性疾病具有多靶點(diǎn)、抑菌譜廣、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，近年來(lái)引起越來(lái)越多學(xué)者關(guān)注[4]。傣醫(yī)藥是四大民族醫(yī)藥之一，具有2500多年的應(yīng)用歷史，其以“四塔”、“五蘊(yùn)”為理論核心，具有獨(dú)特和完整的理論體系，為傣族和邊疆人民的繁衍生息作出了巨大貢獻(xiàn)[5]。

本研究選取名老傣醫(yī)林艷芳教授臨床常用于感染性疾病治療的7種傣藥材，以大腸桿菌和綠膿假單胞菌作為指示菌，對(duì)選取的藥材乙醇提取物用不同極性溶劑萃取，獲得的提取物進(jìn)行體外抑菌對(duì)比實(shí)驗(yàn)，為臨床應(yīng)用和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材與試劑 白花臭牡丹根、栘皮、海船皮、勐臘大解藥、藤甘草、野甘草、竹葉蘭由云南雅解傣藥堂科技有限公司提供，基源由林艷芳教授鑒定為各個(gè)藥材飲片的干燥藥用部位。

LB培養(yǎng)基（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司），瓊脂（美國(guó)Invitrogen公司），葡萄糖（美國(guó)Sigma公司），瓊脂粉（日本Japan公司），DMSO（美國(guó)Sigma公司）。

試劑均為分析純。

1.2 供試菌種 菌種：綠膿假單胞菌（Pa.，博偉生物技術(shù)有限公司），大腸桿菌（Ec.，天津賽爾生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器設(shè)備 流水式粉碎機(jī)（DF-35，溫州大德），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EV241，北京萊伯泰科儀器股份有限公司），恒溫水浴鍋（HWS-24，上海一恒科學(xué)儀器有限公司），電子天平（ME204，梅特勒-托利斯），鼓風(fēng)干燥箱（BGZ-246，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱（ST20H，冠森生物科技上海公司），超凈工作臺(tái)（HCB-1300V，青島海爾特種電器有限公司），高壓滅菌鍋（GI80TW，廈門致微儀器有限公司），臺(tái)式離心機(jī)（L420，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

2 方法[6-8]

2.1 提取物和陽(yáng)性對(duì)照藥的制備 取7種傣藥材，打粉過(guò)20目篩，備用。分別稱取100g各種傣藥材，加10倍量95%乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液減壓濃縮至無(wú)醇。提取物加適量熱水混懸后，放置至室溫，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，獲得乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。萃取物及編號(hào)見(jiàn)表1。

提取物溶液的配制：將各萃取物的水部分用超純水溶解，母液濃度為250mg/mL，稀釋至終濃度25mg/mL，0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌備用;乙酸乙酯和正丁醇萃取部位用0.2%的DMSO-水溶解，母液濃度為250mg/mL，稀釋至終濃度25mg/mL，0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌備用。

陽(yáng)性對(duì)照藥的配制：準(zhǔn)確稱取25mg對(duì)羥基苯甲酸乙酯，溶1mL無(wú)水乙醇，制得25mg/mL對(duì)照品溶液，0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌備用。

2.2 試劑的配制

2.2.1 LB培養(yǎng)基的制備 10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、氯化鈉10g，15g瓊脂粉，加蒸餾水至950mL，混勻后，NaOH調(diào)pH至7.0，加水至1000mL，121℃高壓20min。

2.2.2 營(yíng)養(yǎng)胨培養(yǎng)基的制備 10g蛋白胨、3g牛肉膏、氯化鈉5g，15g瓊脂粉，加蒸餾水至950mL，混勻后，NaOH調(diào)pH至7.2～7.4，加水至1000mL，121℃高壓20min。

2.2.3 菌液的制備 將4℃下保存的綠膿假單胞菌和大腸桿菌菌種，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃孵育24h，挑取菌落至瓊脂液體培養(yǎng)基，搖菌培養(yǎng)12h后，用生理鹽水校正，與0.5麥?zhǔn)媳葷?，將含菌量調(diào)至1.0×105cfu/mL。

2.2.4 含菌平板的制備 將15mL滅菌瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿制平板，待平板完全凝固冷卻，取100μL稀釋好的濃度1.0×105cfu/mL菌液至培養(yǎng)皿內(nèi)，用無(wú)菌棒涂抹均勻，封口膜密封后放4℃冰箱備用。

2.3 濾紙片法測(cè)定抑菌圈 取滅菌雙層圓形濾紙片（6mm），將濾紙浸在各樣品溶劑中，設(shè)DMSO和純水空白對(duì)照，對(duì)羥基甲酸乙酯陽(yáng)性對(duì)照。取出濾紙片晾干，輕輕放在含菌平板的相應(yīng)位置;貼好濾紙片的含菌平板倒置放入4℃冰箱靜置2h后，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h;培養(yǎng)結(jié)束后，用精確度為1/10mm的游標(biāo)卡尺十字交叉測(cè)量抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3個(gè)平行組的平均值。抑菌圈越大，表示抑菌效果越好。

2.4 二倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC） 采用試管等倍稀釋法，量取1.0mL樣品濃度為50mg/mL的溶液加入到第一支試管中，再加入1mL滅菌培養(yǎng)基;從第一支試管中取出1mL溶液，滴加到第二支試管中，依此類推至第九管。第10管含有2mL培養(yǎng)基，并棄去1mL;同時(shí)以1mL相同濃度的DMSO和純水代替藥物提取物與培養(yǎng)基混合做空白對(duì)照，相同濃度的對(duì)羥基苯甲酸乙酯為陽(yáng)性對(duì)照;采用微量加樣器向各試管中均加入制備好的菌懸液100μL（1×105cfu/mL），搖勻后放入培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h，取出試管充分震蕩混勻，并對(duì)各個(gè)試管進(jìn)行檢查，用肉眼觀察期渾濁度，以此來(lái)判斷有無(wú)菌生長(zhǎng);對(duì)照管中菌呈現(xiàn)渾濁狀生長(zhǎng)，溶液開(kāi)始出現(xiàn)澄清的最低濃度確定為樣品的MIC值。

2.5 最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定 自樣品濃度高于MIC值（包括MIC濃度）的試管中各吸取100μL混懸液分別滴加到滅菌的平板培養(yǎng)基上，涂布均勻，培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h，肉眼觀察結(jié)果，菌落數(shù)小于5個(gè)或無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低樣品濃度確定為MBC值。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，每組數(shù)據(jù)3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P<0. 05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 各提取物均具有抑制大腸桿菌和綠膿假單胞菌生長(zhǎng)的活性 抑菌圈的檢測(cè)是為了對(duì)比在同種濃度下不同提取物的抑菌活性大小，抑菌圈越大，說(shuō)明抑菌活性越好。表2的檢測(cè)結(jié)果顯示：7種解藥提取物的不同極性萃取部位均具有抑制大腸桿菌和綠膿假單胞菌的活性，抑菌圈檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)綠膿假單胞菌抑制效果最好的為MLDJY-2，即勐臘大解藥正丁醇萃取部位，抑菌圈為（2.80±0.07）cm，與陽(yáng)性對(duì)照藥效果相當(dāng);效果最差的為ZYL-3，即竹葉蘭水部位，抑菌圈為（1.21±0.04）cm。

對(duì)大腸桿菌的抑菌圈檢測(cè)結(jié)果顯示：大部分萃取物均顯示不同程度抑制綠膿假單胞菌生長(zhǎng)的效果，抑菌圈直徑測(cè)量結(jié)果顯示，對(duì)銅綠假單胞菌抑菌效果最好的為MLDJY-2，即勐臘大解藥乙酸乙酯萃取物，抑菌圈為（1.96±0.03）cm，其次為DY-1，即栘乙酸乙酯萃取物，抑菌圈為（1.93±0.10）cm。

3.2 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 最小抑菌濃度是指在特定環(huán)境下孵育24h，可抑制某種微生物出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)的最低藥物濃度，試驗(yàn)時(shí)肉眼未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為MIC。同一細(xì)菌對(duì)不同藥物的敏感性用MIC值衡量，值越小，說(shuō)明越敏感，其抗菌藥物的作用越強(qiáng)。檢測(cè)結(jié)果顯示：七種傣藥解藥不同極性萃取物均可檢測(cè)最小抑菌濃度，MLDJY-1、MLDJY-2和DY-2、BHCMD-2對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.195mg/mL，與陽(yáng)性對(duì)照藥效果一致;DY-2和MLDJY-2在0.781mg/mL濃度下顯示出最綠膿假單胞菌的最小抑菌濃度。

3.3 最小殺菌濃度（MBC）的檢測(cè) 最小殺菌濃度（MBC）是最初的試驗(yàn)活菌數(shù)減少99.9%或以上所需要的最低抗菌藥物的濃度。由表5實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，七種傣藥解藥品種不同極性萃取物對(duì)大腸桿菌的最小殺菌濃度均優(yōu)于對(duì)綠膿假單胞菌的最小殺菌濃度。MLDJY-2對(duì)大腸桿菌的MBC為3.125mg/mL，效果最好;MLDJY-1、MLDJY-2、DY-2和HCP-1對(duì)綠膿假單胞菌的MBC為6.25mg/mL;BHCMD-3、TGC-3和YGC-3均為檢測(cè)出對(duì)大腸桿菌和綠膿假單胞菌的MBC。

4 討論

大腸桿菌（Escherichia coli），又叫大腸埃希氏菌，是條件致病菌，是人和動(dòng)物腸道中最主要和數(shù)量最多的一種細(xì)菌，主要寄生于大腸內(nèi)。在一定條件下可以引起人和多種動(dòng)物發(fā)生胃腸道感染或尿道等多種局部組織器官感染[9]。綠膿假單胞菌（Pesudomonas pyocyaneum），是一種革蘭氏陰性菌、好氧、呈長(zhǎng)棒形的細(xì)菌，廣泛分布于自然界及正常人皮膚、腸道和呼吸道，由于對(duì)抗菌素有較強(qiáng)的抗性，已成了醫(yī)院內(nèi)感染的重要細(xì)菌，是臨床上較常見(jiàn)的條件致病菌之一[10]。

本研究抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：7種傣藥材不同極性提取物均顯示抑菌活性，各藥材乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的抑菌活性優(yōu)于水萃取物，可能由于水部位含糖量較高，有利于細(xì)菌生長(zhǎng)，而其他部位的一類或幾類次生代謝產(chǎn)物之間相互作用發(fā)揮抑菌活性。7種傣藥材提取物中，勐臘大解藥（平脈藤）乙酸乙酯萃取部位抑菌效果最好，有研究報(bào)道，勐臘大解藥中的主要抑菌成分為異戊烯化苯甲酸衍生物[11]，其他成分未見(jiàn)報(bào)道。栘樹(shù)皮和海船皮中中主要含有黃酮類成分[12-13]，野甘草中含有二萜、生物堿、黃酮、三萜等類型成分[14]，竹葉蘭中含有內(nèi)酯、香豆素、黃酮、多糖等成分[15]，選取的傣藥材雖然臨床應(yīng)用歷史悠久，效果顯著，但其發(fā)揮抑菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，作用機(jī)制不清楚等問(wèn)題。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果為傣藥材抗菌活性和作用機(jī)制的研究奠定了前期基礎(chǔ)，為傣藥產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化研究提供探索途徑。

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（收稿日期：2020-08-13 編輯：劉斌）