居馬別克·夏拉巴依，馬曉艷，阿曼古麗·加孜，美熱木古麗·巴依待拉提，任 娟，王 文，李 舵

(1.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，烏魯木齊 830011)

犢牛腹瀉是多種病因引起的一種臨床常見(jiàn)疾病，也是導(dǎo)致?tīng)倥Ｋ劳龅闹匾颍梢愿爬ǖ姆譃榉莻魅拘愿篂a和傳染性腹瀉[1]。非傳染性腹瀉是由飼養(yǎng)管理不善、營(yíng)養(yǎng)缺失、飼料調(diào)配不合理、飼料中毒、天氣變化和長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)炔⒎遣≡腥疽蛩匾鸬母篂a。傳染性腹瀉是由病毒(如冠狀病毒、輪狀病毒)、細(xì)菌(如產(chǎn)氣莢膜梭菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌等致病菌)、寄生蟲(chóng)(如微小隱孢子蟲(chóng)、球蟲(chóng)、線蟲(chóng))等病原體引起的腹瀉[2，3]。該病在犢牛中均為常見(jiàn)疾病，多發(fā)生于2月齡內(nèi)的犢牛，造成1月齡以下?tīng)倥Ｋ劳龅闹饕蛑?，?yán)重時(shí)可導(dǎo)致70%的犢牛發(fā)病，病死率高達(dá)50%[4，5]。本文選擇新疆北疆地區(qū)9個(gè)規(guī)模化牛場(chǎng)，開(kāi)展牛傳染性犢牛腹瀉調(diào)查與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，分析牛場(chǎng)傳染性犢牛腹瀉發(fā)病情況，為臨床防治提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年10月31日至2019年6月20日，分別在新疆北疆伊犁州、阿勒泰、塔城每個(gè)區(qū)選擇2～3個(gè)規(guī)?；B(yǎng)牛場(chǎng)及養(yǎng)殖合作社，以詢問(wèn)或查閱資料方式，填寫(xiě)犢牛傳染性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查情況表，重點(diǎn)采集新生犢牛有腹瀉，糞便呈稀軟、水樣狀態(tài)，后期食欲減退，難以站立或出現(xiàn)昏迷等癥狀的樣品，在伊犁州新源縣、塔城市、阿勒泰市的3個(gè)種牛場(chǎng)、6個(gè)規(guī)模場(chǎng)采集有上述癥狀的牛糞便或肛門(mén)拭子樣品共234份。

1.2 試劑和儀器

消化道ELISA抗原檢測(cè)試劑盒購(gòu)自青島瑞爾生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào):DIG17K30；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、血瓊脂等培養(yǎng)基、蓋玻片、10種藥敏紙片購(gòu)自烏魯木齊天和眾鑫商貿(mào)有限公司；麥康凱瓊脂、SS瓊脂、沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、焦性沒(méi)食子酸購(gòu)自烏魯木齊牧源康獸藥器械經(jīng)銷部。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)

1.3.1.1 增菌培養(yǎng) 無(wú)菌抽取采集阿勒泰地區(qū)、伊犁州新褐牛場(chǎng)、塔城地區(qū)種牛場(chǎng)的犢牛糞便進(jìn)行增菌培養(yǎng)，無(wú)菌取0.5 g接種至9 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～24 h；同時(shí)挑取糞便，無(wú)菌取0.5 g接種至7 mL厭氣肝湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24～48 h。24 h后觀察是否有菌落產(chǎn)生，如果有，再進(jìn)行培養(yǎng)、純化。

1.3.1.2 鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng) 繼續(xù)用接種環(huán)無(wú)菌取以上兩種培養(yǎng)后的增菌液，每份分別劃線接種在麥康凱瓊脂平板、血瓊脂平板和SS瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h。

1.3.1.3 染色鏡檢 以上三種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的典型菌落，用接種環(huán)取涂片革蘭氏染色后鏡檢觀察。

1.3.1.4 生化試驗(yàn) 按照細(xì)菌微量生化反應(yīng)管(購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司)，對(duì)分離到的菌株進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)，操作方法與判定結(jié)果參照說(shuō)明書(shū)。

1.3.2 藥敏試驗(yàn)

采用紙片法對(duì)分離到的致病菌進(jìn)行10種常見(jiàn)抗生素藥敏紙片藥敏試驗(yàn)。按照K-B法試驗(yàn)要求，每張紙片間距不得少于24 mm，紙片中心距離平皿邊緣不少于15 mm。同時(shí)做兩個(gè)平板，進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，平皿置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察記錄結(jié)果。

1.3.3 消化道ELISA與球蟲(chóng)檢測(cè)

采集糞便樣品前處理，按照消化道ELISA抗原檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，該試劑盒可以鑒別檢測(cè)輪狀病毒、冠狀病毒、大腸桿菌F5(K99)、微小隱孢子蟲(chóng)，同時(shí)采集的樣品用漂浮法對(duì)樣品進(jìn)行球蟲(chóng)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

近1年時(shí)間，奔赴新疆北疆三個(gè)地區(qū)，到伊犁州、塔城地區(qū)、阿勒泰地區(qū)的3個(gè)種畜場(chǎng)、6個(gè)規(guī)模場(chǎng)共9個(gè)場(chǎng)點(diǎn)，采集糞便234份，如下表1顯示。

2.1 牛場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查情況

根據(jù)規(guī)?；?chǎng)流行病學(xué)調(diào)查情況分析發(fā)現(xiàn)，新疆北疆片區(qū)大部分規(guī)模牛場(chǎng)及養(yǎng)牛合作社都有犢牛腹瀉病例發(fā)生，發(fā)病率40%左右、死亡率14%左右。在9個(gè)牛場(chǎng)的1月齡以內(nèi)的犢牛腹瀉2017年的發(fā)病率為45.64%，死亡率為13.67%，2018年的發(fā)病率為39.4%，死亡率為13.87%，2019年4個(gè)規(guī)?；?chǎng)的1月齡以內(nèi)的犢牛腹瀉發(fā)病率為32.86%，死亡率為14.14%。

2.2 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

2.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

24 h后觀察菌落形態(tài)，有138份樣品在麥康凱瓊脂平板上出現(xiàn)紅色或粉紅色菌落、有5份出現(xiàn)透明發(fā)白小菌落；有123份樣品在SS瓊脂平板上出現(xiàn)粉紅色菌落、有1份出現(xiàn)透明發(fā)白小菌落，麥康凱和SS瓊脂生長(zhǎng)的發(fā)白小菌落在后期增菌培養(yǎng)沒(méi)有得到相應(yīng)菌株，其余4份無(wú)菌落；在血瓊脂平板上有15份出現(xiàn)乳白色小菌落β溶血。

2.2.2 鏡檢

在3種鑒別培養(yǎng)基上挑取接種典型的菌落、將菌落涂片革蘭氏染色后鏡檢觀察，大多是短粗狀桿菌，從培養(yǎng)基生長(zhǎng)特性和鏡檢結(jié)果可確定15株致病性大腸桿菌。如圖1-圖4。

圖1 麥康凱培養(yǎng)基菌落

圖2 SS瓊脂培養(yǎng)基菌落

圖3 致病菌在血瓊脂培養(yǎng)基菌落

圖4 顯微鏡觀察結(jié)果（大腸桿菌）

2.2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

觀察藥敏片周?chē)袥](méi)有肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)物區(qū)域?yàn)橐志Γ褂糜螛?biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷細(xì)菌對(duì)抗菌藥的敏感性(見(jiàn)表2)，結(jié)果分為高敏感、中敏感、耐藥。藥敏試驗(yàn)結(jié)果是大腸桿菌對(duì)卡那霉素、磺胺嘧啶、頭孢噻呋敏感、替米考星和氟苯尼考中敏感，其它藥物都表現(xiàn)為耐藥。

表2 藥敏試驗(yàn)判斷結(jié)果

2.3 消化道ELISA抗原檢測(cè)結(jié)果

由于采集樣品數(shù)量較多，挑取有臨床癥狀非常明顯的樣品，用消化道ELISA抗原試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)試劑盒通過(guò)用腹瀉病病原特異性抗體包被96孔微量板，抗體可以捕獲糞便中相應(yīng)的致病病原。

隨機(jī)選取不同采集點(diǎn)有腹瀉癥狀的234份樣品，經(jīng)ELISA檢測(cè)，沒(méi)有檢測(cè)到冠狀病毒抗原，檢測(cè)到15份輪狀病毒抗原，檢測(cè)到20份微小隱孢子蟲(chóng)抗原，檢測(cè)到7份大腸桿菌F5抗原。其中伊犁州的種牛場(chǎng)、規(guī)模場(chǎng)共47份樣品均沒(méi)有檢測(cè)到輪狀病毒、冠狀病毒、大腸桿菌F5、微小隱孢子蟲(chóng)抗原，阿勒泰地區(qū)、塔城地區(qū)牛場(chǎng)檢出不同數(shù)量的大腸桿菌F5、微小隱孢子蟲(chóng)抗原和輪狀病毒，其中微小隱孢子蟲(chóng)檢出的陽(yáng)性率最高，所有糞便樣品檢測(cè)結(jié)果如下表3、圖5所示。

圖5 北疆規(guī)模化牛場(chǎng)消化道ELISA抗原陽(yáng)性率結(jié)果

表3 新疆北疆三個(gè)地區(qū)糞便樣品ELISA檢測(cè)結(jié)果（份）

3 討論與分析

犢牛傳染性腹瀉是危害犢牛的常見(jiàn)病之一，有明顯的季節(jié)性，常發(fā)于冬季和春季，還可以導(dǎo)致地方性流行［6，7］。本文流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)阿勒泰地區(qū)有的規(guī)模化牛場(chǎng)夏季也有病例發(fā)生(10月份至次年的6月份)。

腹瀉犢牛臨床癥狀主要表現(xiàn)為出現(xiàn)白色或者黃色糞便，水樣棕色糞便為主，發(fā)生的日齡在1～28 d的范圍內(nèi)。導(dǎo)致?tīng)倥８篂a的原因很多，其中大腸桿菌是犢牛腹瀉的主要原因之一。大腸桿菌作為腸道菌群的重要組成部分，一般是非致病的，一些特殊血清型的大腸桿菌可導(dǎo)致家畜的腹瀉及敗血，對(duì)家畜具有致病性［8，9］。大腸桿菌經(jīng)藥敏試驗(yàn)，挑選出卡那霉素、磺胺嘧啶、頭孢噻呋三種高敏感藥物，為臨床提供可行性治療藥物［10］。

從上述三個(gè)地區(qū)發(fā)病情況來(lái)看，阿勒泰地區(qū)犢牛腹瀉感染陽(yáng)性率較塔城、伊犁州高，一方面是臨床獲取的樣本量少，臨床判定的疏漏和檢測(cè)方法的差異，不能整體反映三個(gè)地區(qū)各個(gè)牛場(chǎng)陽(yáng)性率情況；另一方面是和養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理水平有關(guān)系，在飼養(yǎng)條件、圈舍消毒、殺蟲(chóng)、疫病防治等方面都有所改善，犢牛傳染性腹瀉還需與其他常見(jiàn)病開(kāi)展鑒別診斷。

4 結(jié) 論

本次調(diào)查新疆北疆規(guī)?；?chǎng)牛傳染性腹瀉感染情況不容忽視，所有樣品經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)到大腸桿菌15株，經(jīng)藥敏試驗(yàn)，對(duì)磺胺嘧啶、卡那霉素、頭孢噻呋高敏感、替米考星和氟苯尼考中敏感，用消化道ELISA抗原試劑盒沒(méi)有檢測(cè)到冠狀病毒抗原，檢測(cè)到15份輪狀病毒抗原，陽(yáng)性率為6.41%，20份微小隱孢子蟲(chóng)抗原，陽(yáng)性率為8.54%，7份大腸桿菌F5抗原，陽(yáng)性率為2.99%；所有糞便樣品均沒(méi)有檢測(cè)到球蟲(chóng)，此次調(diào)查結(jié)果可以為北疆牛場(chǎng)犢牛腹瀉提供臨床治療方案。

以上檢測(cè)結(jié)果分析顯示：經(jīng)輪狀病毒感染的犢牛樣品主要采自阿勒泰地區(qū)的規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)及養(yǎng)殖合作社的一個(gè)月齡以內(nèi)的犢牛都有腹瀉癥狀，大腸桿菌、微小隱孢子蟲(chóng)感染陽(yáng)性動(dòng)物臨床癥狀不明顯。為系統(tǒng)性地研究牛場(chǎng)犢牛腹瀉感染情況，后期加大北疆地區(qū)牛場(chǎng)樣本量，涵蓋引起犢牛腹瀉的檢測(cè)項(xiàng)目如牛病毒性腹瀉等，結(jié)合飼養(yǎng)管理因素，更能客觀的反映牛場(chǎng)犢牛腹瀉發(fā)生情況，為預(yù)防本病發(fā)生提供臨床數(shù)據(jù)。