張凱龍，倪貌貌，顧 瑋，宋亞萍，郭 斌，汪財(cái)生

（1 浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院 浙江寧波315100 2 寧波鄞州中銘農(nóng)業(yè)科技有限公司 浙江寧波315100）

天然色素具有安全性高、營(yíng)養(yǎng)豐富、色調(diào)自然等優(yōu)點(diǎn)，在消費(fèi)市場(chǎng)具有極高的認(rèn)可度[1-2]，目前已建立多種色素檢測(cè)分析方法[3-4]。桑葚富含花色苷類化合物，色彩鮮艷，色價(jià)高，以其為原料提取的色素，可廣泛應(yīng)用于高端食品、日用品、化妝品和藥品等領(lǐng)域。近年來(lái)的研究表明天然色素具有一定的生理活性[5-10]，具有巨大的開(kāi)發(fā)利用潛力。

桑葚成熟期氣溫高，成熟集中、果期短，采摘不便，貯存困難，易造成巨大浪費(fèi)和環(huán)境污染。開(kāi)展桑葚色素高值化利用研究，拓展利用途徑，提高產(chǎn)品附加值，對(duì)促進(jìn)農(nóng)業(yè)增收具有重要意義。目前，關(guān)于桑葚色素?zé)岱€(wěn)定性的研究較多，但結(jié)果差異較大。光、包裝材料、氧化劑及添加劑等對(duì)桑葚色素穩(wěn)定性影響的研究較少，且普遍使用定性描述，因此建立桑葚色素穩(wěn)定性準(zhǔn)確、全面的定量描述極為必要[11-13]。

目前，天然色素穩(wěn)定性研究中多采用單條件控制、手動(dòng)離散取樣測(cè)定方案，勞動(dòng)強(qiáng)度大，樣品容易受到污染，測(cè)定準(zhǔn)確性較差，不便于考察多種條件如溫度、光照、pH 值、氧化、添加劑等對(duì)穩(wěn)定性的影響[14-17]。本研究開(kāi)發(fā)了一種多條件控制在線光度法實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)測(cè)定裝置，基于該裝置采用初始動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定桑葚色素穩(wěn)定性。本研究結(jié)果為桑葚色素開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持，為天然色素穩(wěn)定性研究提供新的測(cè)試方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

甲酸、氫氧化鈉、乙酸、三水乙酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、過(guò)氧化氫、維生素C（分析純級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

桑葚由寧波鄞州中銘農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，成熟果實(shí)，外觀呈紫黑色。

1.2 設(shè)備與儀器

SCIENTZ-18N 型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；GX-3020 型恒溫循環(huán)器，寧波海曙億恒儀器有限公司；DC-1006 型低溫恒溫槽，寧波天恒儀器廠；FE20 型pH 計(jì)，梅特勒-托利多集團(tuán)；78-1 型磁力攪拌器，金壇大地自動(dòng)化儀器廠；Model 910-0025 型蠕動(dòng)泵，賽默飛世爾公司；5 W 紫外燈（主波長(zhǎng)254 nm），廣東雪萊特光電科技有限公司；ULTRA-VITALUX 型日光模擬燈（標(biāo)識(shí)功率300 W，其中波長(zhǎng)315～400 nm 的輻射功率13.6 W，波長(zhǎng)280～315 nm 的輻射功率3.0 W），歐司朗（中國(guó)）照明有限公司；400 μL 流動(dòng)比色皿，宜興市譜析光學(xué)元件有限公司；UV3200PCS 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；2 mm 厚石英玻璃、2 mm 厚光學(xué)玻璃、1 mm 厚棕色光學(xué)玻璃，宜興市譜析光學(xué)元件有限公司；0.15 mm 厚PET 平板，剪裁于市售大包裝農(nóng)夫山泉純凈水瓶平坦部分。

1.3 試驗(yàn)方法

反應(yīng)器有效容積100 mL，連接管路長(zhǎng)度約60 cm，連接管內(nèi)徑1.6 mm，管路及流動(dòng)比色皿體積約1.6 mL。

桑葚果肉水提液過(guò)大孔樹(shù)脂，合并色素洗脫液冷凍干燥，所得粉末為桑葚色素混合物，以緩沖溶液配制桑葚色素儲(chǔ)備液。

移取一定量桑葚色素溶液加入反應(yīng)器，設(shè)置控制條件，采集吸光度數(shù)據(jù)，采樣間隔1 min，總時(shí)長(zhǎng)5 h。桑葚色素降解反應(yīng)速率常數(shù)較低，5 h 測(cè)定為其初始動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多條件在線光度法動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)采集裝置

如圖1所示，裝置主要由7 部分組成。反應(yīng)器為具有色素溶液流入流出接口的夾層燒杯，夾層通入恒溫循環(huán)水保持體系溫度穩(wěn)定。反應(yīng)器下方設(shè)置有磁力攪拌器，上方設(shè)置有光線阻隔材料平板，平板上方為外置光源，反應(yīng)器內(nèi)筒中色素溶液在蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)下流經(jīng)流動(dòng)比色皿-分光光度計(jì)檢測(cè)器測(cè)定后流回循環(huán)。

圖1 多條件在線光度法動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)裝置Fig.1 Multi-conditions controlled online spectrophotometry experimental device for kinetics study

裝置管道及比色皿存在一定“死體積”，對(duì)反應(yīng)器內(nèi)樣品施加實(shí)時(shí)“非全體性”影響時(shí)（如光照），理論上存在微小延遲，通過(guò)延遲動(dòng)力學(xué)方程可予以消除，-dcp/d（t-τ）=kAmP，τ為“死體積”對(duì)應(yīng)延遲時(shí)間（h）。當(dāng)反應(yīng)速率常數(shù)較低、“死體積”遠(yuǎn)小于反應(yīng)器容積、蠕動(dòng)泵快速循環(huán)時(shí)，流動(dòng)比色皿內(nèi)溶液和反應(yīng)器內(nèi)溶液視為等效。

試驗(yàn)裝置適用于慢速液體均相動(dòng)力學(xué)過(guò)程初始、全程實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)自動(dòng)在線采集。測(cè)定天然色素褪色動(dòng)力學(xué)時(shí)，向反應(yīng)器內(nèi)加入色素溶液，設(shè)置循環(huán)水溫度、pH 值、外置光源、光線阻隔材料平板、添加物種類和濃度等一種或多種條件組合，開(kāi)啟攪拌和蠕動(dòng)泵，分光光度計(jì)設(shè)置為動(dòng)力學(xué)模式，檢測(cè)波長(zhǎng)為色素溶液最大吸收波長(zhǎng)，設(shè)置采樣間隔，采集數(shù)據(jù)。

溫度20℃，以去離子水為參比，在反應(yīng)器內(nèi)加入去離子水循環(huán)1 h，吸光度最大差值ΔAmax=0.0021，表明試驗(yàn)裝置及測(cè)量系統(tǒng)噪音極低，具有良好的穩(wěn)定性。

2.2 桑葚色素酸堿穩(wěn)定性

桑葚色素用pH 值為3，4，5，6，7，8 的緩沖溶液稀釋，在波長(zhǎng)400～800 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖2所示，溶液顏色如插圖所示，pH 值對(duì)桑葚色素顏色影響明顯。pH 值為3 時(shí)溶液中桑葚色素呈現(xiàn)純正紅色，鮮艷濃厚，適用于食品、藥品、化妝品等產(chǎn)品調(diào)色，是桑葚色素最佳酸堿環(huán)境，最大吸收波長(zhǎng)514 nm。pH 值從3 增大為8 時(shí)，對(duì)應(yīng)最大吸收波長(zhǎng)紅移，紅色變淺并逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色、紅棕色，顏色劣化，感官評(píng)價(jià)變差。

圖2 不同pH 值桑葚色素顏色Fig.2 Color of mulberry pigments at different pH value

pH 值為3 時(shí)，以吸光度A0=0.968 的桑葚色素溶液為儲(chǔ)備液，分別移取0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 份儲(chǔ)備液稀釋到1 份，吸收光譜無(wú)變化，稀釋曲線線性良好，如圖3所示。色素降解過(guò)程中在波長(zhǎng)514 nm 處監(jiān)測(cè)吸光度的變化。

圖3 pH 值為3 時(shí)桑葚色素溶液稀釋曲線Fig.3 Dilution curve of mulberry pigment at pH 3

2.3 桑葚色素?zé)岱€(wěn)定性

在室內(nèi)自然光照，pH 值為3，反應(yīng)體系溫度分別為20～80℃，吸光度變化如圖4a所示。由圖4a 可知，20～50℃吸光度下降緩慢，20℃時(shí)桑葚色素吸光度5 h 僅降低0.004，主要為系統(tǒng)噪音貢獻(xiàn)，60℃開(kāi)始吸光度降速增加，并隨溫度升高加劇。對(duì)圖4a 吸光度變化進(jìn)行一次動(dòng)力學(xué)擬合，結(jié)果如圖4b所示，擬合反應(yīng)速率常數(shù)及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)圖4a 插表，20℃時(shí)吸光度變化過(guò)小，因噪音掩蓋失真，相關(guān)系數(shù)低，僅作為參考。30℃反應(yīng)速率常數(shù)k30℃=0.0023 h-1，半衰期τ30℃=301.4 h，80℃反應(yīng)速率常數(shù)k80℃=0.0492 h-1，半衰期τ80℃=14.1 h，表明桑葚色素對(duì)溫度敏感，20℃及以下溫度冷藏能長(zhǎng)期保持顏色穩(wěn)定，溫度過(guò)高會(huì)加速花色苷破壞。

對(duì)不同溫度反應(yīng)速率常數(shù)按照阿倫尼烏斯方程ln（k）=lnA-Ea/（RT）擬合，如圖4b 插圖所示，表觀活化能Ea=60.2 kJ/mol，較大的活化能表明桑葚色素降解較為緩慢。溫度對(duì)色素穩(wěn)定性影響體現(xiàn)在2 方面：一方面溫度會(huì)影響氧化、還原、光解過(guò)程反應(yīng)速率常數(shù)，另一方面升高溫度使花色苷分子自身熱分解更加顯著。因此，溫度對(duì)于色素穩(wěn)定性極為關(guān)鍵，在生產(chǎn)、貯存、運(yùn)輸、貨架等環(huán)節(jié)注意保持低溫。

圖4 桑葚色素?zé)岱€(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of mulberry pigments

2.4 桑葚色素光穩(wěn)定性

20℃條件下，反應(yīng)器加蓋石英玻璃片，分別在距液面30 cm 和10 cm 處設(shè)置日光模擬燈和紫外燈，吸光度變化如圖5所示，一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合見(jiàn)圖5內(nèi)插圖、表。日光模擬燈功率較大，然而燈光呈錐狀發(fā)散從而僅有部分投射到色素液面；紫外燈功率小，但光線較為集中，計(jì)算ksun=0.0152 h-1、kuv=0.0181 h-1，較為接近，同時(shí)也表明光照，特別是紫外光會(huì)加速色素降解。紫外光能量較高，與共價(jià)鍵鍵能較為接近，紫外線暴露將破壞花色苷分子結(jié)構(gòu)，發(fā)生褪色。

圖5 桑葚色素光穩(wěn)定性Fig.5 Light stability of mulberry pigments

包裝材料是色素相關(guān)產(chǎn)品需要考察的重要因素，需盡可能平衡產(chǎn)品展示感官和避光需求。選用常用的石英玻璃、光學(xué)玻璃、棕色光學(xué)玻璃、PET材質(zhì)平板，在波長(zhǎng)200～800 nm 處測(cè)定其透射光譜（圖6）。在20℃，距液面30 cm 處設(shè)置日光模擬燈，不同光線阻隔材料下桑葚色素降解曲線如圖7所示，一級(jí)擬合動(dòng)力學(xué)見(jiàn)圖7插圖、表。

圖6 不同材料透光率Fig.6 Transmittance of different materials

圖7 不同阻隔材料下桑葚色素的光穩(wěn)定性Fig.7 Light stability of mulberry pigments under different barriers

石英在波長(zhǎng)200～800 nm 區(qū)間內(nèi)全透過(guò)，僅在波長(zhǎng)接近200 nm 處的低波長(zhǎng)高能紫外線透過(guò)率略有下降，相應(yīng)色素降解速率最大。光學(xué)玻璃和PET 均有良好的可見(jiàn)光透過(guò)性，當(dāng)波長(zhǎng)低于350 nm 時(shí)，近紫外線透光率快速下降；當(dāng)波長(zhǎng)在300 nm 左右，透光率降為零，表現(xiàn)出較好紫外線屏蔽能力。PET 透光波長(zhǎng)及強(qiáng)度都略低于光學(xué)玻璃，相應(yīng)反應(yīng)速率常數(shù)也較低。由于日光模擬燈低波長(zhǎng)紫外區(qū)功率較低且照射分散，因此使用石英玻璃和光學(xué)玻璃、PET 片的色素降解速率較為接近。棕色玻璃在可見(jiàn)光區(qū)透過(guò)率較低，在波長(zhǎng)350 nm 處透過(guò)率接近零，僅在波長(zhǎng)350～400 nm 的近紫外區(qū)有少量透過(guò)，對(duì)紫外光具有良好的屏蔽作用，降解反應(yīng)速率最低，為0.0096 h-1，半衰期達(dá)到72.2 h。對(duì)色素產(chǎn)品應(yīng)選擇紫外光阻隔性能較好的包裝材料、被膜，避光貯存，有助于減緩色素光降解褪色的速度。

2.5 桑葚色素氧化穩(wěn)定性

20℃，距液面30 cm 設(shè)置日光模擬燈，用過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)色素溶液中過(guò)氧化氫濃度分別為2.5，5.0，10.0 mmol/L，吸光度變化如圖8所示，一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合見(jiàn)圖8插圖、表。相較光照，桑葚色素對(duì)過(guò)氧化氫表現(xiàn)出極不耐受，反應(yīng)速率常數(shù)呈現(xiàn)數(shù)量級(jí)式增加，隨著氧化劑濃度提高，色素劇烈降解?？諝庵醒鯕?、溶解氧在一定條件下產(chǎn)生羥基、過(guò)氧自由基等活性氧化物，攻擊桑葚花色苷分子，破壞其分子結(jié)構(gòu)，發(fā)生褪色。光照會(huì)催化該過(guò)程，增加自由基產(chǎn)生，加速降解[18]。

圖8 桑葚色素氧化穩(wěn)定性Fig.8 Oxidative stability of mulberry pigments

日光模擬燈光照的無(wú)過(guò)氧化氫添加體系中加入還原劑VC，桑葚色素降解及其一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合如圖9所示。VC 可以還原反應(yīng)體系少量氧化劑，捕獲氧化性自由基，添加適量VC 對(duì)色素降解表現(xiàn)出抑制作用。

圖9 不同濃度VC 對(duì)色素降解的影響Fig.9 Effects of concentrations of VC on the degradation

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了一種基于在線光度法的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)采集裝置和方法。裝置集成度高，方便施加多條件控制，測(cè)定準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可實(shí)現(xiàn)無(wú)人值守自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，大幅降低了測(cè)試工作勞動(dòng)強(qiáng)度，提高了測(cè)試效率，可廣泛應(yīng)用到各類天然色素穩(wěn)定性研究中。利用該裝置測(cè)定了酸堿、熱、光、氧化降解及包裝材料、還原劑保護(hù)對(duì)桑葚色素穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)桑葚色素在pH 值為3 的酸性環(huán)境中呈現(xiàn)鮮艷紅色、色價(jià)高，高溫、紫外光和氧化劑會(huì)加速降解，并獲得了各條件下準(zhǔn)確的降解速率常數(shù)和熱解表觀活化能（60.2 kJ/mol）。冷藏、紫外線阻隔及適量還原劑VC 能有效減緩降解速度，有利于延長(zhǎng)色素及相關(guān)產(chǎn)品貯存時(shí)間及貨架期。