王媛媛，李紅玲

（1.甘肅中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000）

食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，按組織學類型主要分為食管鱗癌和食管腺癌兩種，我國以食管鱗癌為主，而歐美國家以食管腺癌為主。食管癌的首選檢查方法為上消化道內(nèi)鏡檢查，治療方式是以外科手術(shù)治療為主的綜合治療，目前的分期標準采用國際抗癌聯(lián)盟（UICC）及美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）聯(lián)合發(fā)布的第八版食管及食管胃交界部癌TNM分期標準[1]。食管癌作為我國常見的消化道惡性腫瘤，近年來的發(fā)病率呈上升趨勢，因其早期無明顯臨床癥狀，且缺乏特異性分子標記物，多數(shù)患者確診時已是中晚期，預(yù)后差?，F(xiàn)有大量研究表明氧化應(yīng)激在惡性腫瘤的發(fā)展中起重要作用，而Nrf2/ARE信號通路作為氧化應(yīng)激中的關(guān)鍵通路之一，近年來備受研究者關(guān)注。研究主要探討了此信號通路所激活的GCLM和GPX4兩種蛋白在食管鱗狀上皮細胞癌（ESCC）中的表達情況及其臨床病理特征間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

實驗所需標本來源于甘肅省人民醫(yī)院收治的2019年4月-2020年4月的食管鱗癌患者50例，臨床資料完整，入院前均未進行放、化療。其中男性39例，女性11例，年齡43-81歲，中位年齡65歲。鱗狀上皮細胞高分化7例、中低分化43例，TNM臨床分期Ⅰ-Ⅱ期16例，Ⅲ-Ⅳ期34例，同時取20例健康志愿者正常食管組織，其中男性14例，女性6例。研究的所有患者均簽署知情同意書，并獲得甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

采用免疫組化SP法，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行，試劑GCLM（ab126704）購于艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，GPX4（ab125066）購于艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。將石蠟標本切片，厚度4μm，常規(guī)脫臘、水化、修復(fù)，滴加3%H2O2室溫孵育25min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3次，每次3min，滴加正常山羊血清，室溫下封閉30min，傾去血清，滴加一抗（1:400），放入冰箱4℃過夜，滴加生物素標記的羊抗兔IgG室溫孵育50min，PBS沖洗3次，每次3min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，脫水，透明，晾干，封片，置于顯微鏡下觀察分析。結(jié)果判定：每張切片隨機選取5個高倍鏡視野，由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生采用雙盲法進行閱片。陽性結(jié)果以陽性細胞數(shù)得分與染色強度得分的乘積為判定標準，以細胞質(zhì)或細胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性染色。按陽性細胞數(shù)分：≤5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、＞75%為4分，按染色強度分：無著色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。將兩項結(jié)果相乘：0分為陰性（-）、1～4分為弱陽性（+）、5～8分為陽性（++）、9～12分為強陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS22.0軟件進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，GCLM與GPX4的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化法檢測GCLM、GPX4在ESCC中

的表達

GCLM和GPX4的陽性表達主要位于細胞質(zhì)，少量位于細胞核，呈黃色或棕黃色顆粒（如圖1、2所示），GCLM在ESCC中的陽性表達率為84%（42/50）高于其在正常食管組織中的表達率45%（9/20），GPX4在ESCC中的陽性表達率為82%（41/50）高于其在正常食管組織中的表達率25%（5/20），差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001＜0.05，見表1；P=0.000006＜0.05，見表2）。

表1 GCLM在ESCC和正常食管組織（對照組）中的表達 n（%）

表2 GPX4在ESCC和正常食管組織（對照組）中的表達 n（%）

圖1 免疫組化法檢測GCLM的表達（SP法×200）

2.2 GCLM、GPX4的表達與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系

GCLM的表達與患者年齡、性別無關(guān)，與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期有關(guān)，GPX4的表達與患者年齡、性別無關(guān)，與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期有關(guān)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表3）。

表3 GCLM和GPX4與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系

圖2 免疫組化法檢測GPX4的表達（SP法×200）

2.3 ESCC組織中GCLM與GPX4表達間的關(guān)系

根據(jù)Spearman相關(guān)性分析，ESCC患者中的GCLM表達與GPX4表達呈正相關(guān)（r=0.506，P=0.000181＜0.05，見表4）。

表4 GCLM與GPX4在ESCC中陽性表達的關(guān)系

3 討論

3.1 Nrf2/ARE信號通路

此通路為氧化應(yīng)激中的關(guān)鍵通路，機體在正常生理狀態(tài)下Nrf2（核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2）與Keap1（Keleh樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1）結(jié)合存在于細胞胞漿中，維持氧化還原平衡。當細胞受到親電子物質(zhì)或ROS（活性氧）刺激，即發(fā)生氧化應(yīng)激時，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)進入細胞核，并與ARE（抗氧化反應(yīng)元件）結(jié)合，從而激活下游一系列抗氧化酶及解毒酶的表達，如GCL（谷氨酰半胱氨酸鏈接酶）、NQO1（醌氧化還原酶1）、HO-1（血紅素加氧酶1）、GPX(谷胱甘肽過氧化物酶)等，它們可以清除體內(nèi)多種致癌物質(zhì)及毒性物質(zhì)，從而保護機體免受侵害，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，起到抗癌、解毒等作用。此外Nrf2/ARE信號通路還具有抗炎、抗凋亡、抗動脈粥樣硬化、保護神經(jīng)系統(tǒng)等作用[2,3]。

3.2 GCLM

GCLM與GCLC（谷氨酰半胱氨酸鏈接酶催化亞基）結(jié)合形成GCL。GCL原被稱為γ 谷胺酰半胱氨酸合成酶，由輕、重兩條鏈組成，輕鏈即GCLM，重鏈即GCLC。GCL與GSH（谷胱甘肽）的合成有關(guān)，GSH是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸縮合而成的肽類物質(zhì)，存在于機體細胞中，以胞漿中含量最多，GSH作為抗氧化劑可保護機體免受氧化應(yīng)激的損害，在抗腫瘤、增強免疫力等方面發(fā)揮重要作用。研究表明[4,5]增加GCL活性可提高細胞內(nèi)GSH的含量，但當GSH含量過多時又會抑制GCL的表達，而GCLM對GCL的功能起著重要的調(diào)控作用，GCLC是GSH的反饋抑制點，所以當細胞受到氧化應(yīng)激刺激需要合成大量GSH時，GCLM可與GCLC結(jié)合從而消除GSH引起的反饋抑制。Botta等[6]發(fā)現(xiàn)GCLM基因敲除小鼠的GSH含量降低，Brooke等[7]發(fā)現(xiàn)GCLM基因敲除雌性小鼠的受精卵著床會受干擾。Mougiakakos等[8]研究表明GCLC的高水平表達可使腫瘤細胞內(nèi)的ROS含量降低，從而降低腫瘤細胞的增殖速度，Soini Y等[9]研究表明GCLC、GCLM在非小細胞肺癌組織中高表達。研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中的GCLM表達水平明顯高于正常食管組織，GCLM在食管癌中、低分化組的陽性率為90.6%（39/43）明顯高于高分化組42.8%（3/7），在淋巴結(jié)遠處轉(zhuǎn)移組中的陽性率為100%（21/21）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組72.4%（21/29），在臨床分期Ⅲ-Ⅳ期組的陽性率為94.1%（32/34）明顯高于Ⅰ-Ⅱ期組62.5%（10/16），此數(shù)據(jù)表明GCLM的表達水平與食管癌臨床分期及惡性程度成正相關(guān)。

3.3 GPX4

GPX4屬GPX的8種分型即GPX1-GPX8之一，GSH的抗氧化作用主要通過GPX催化完成。有學者通過嘗試去除小鼠的GPX4基因，結(jié)果其在胚胎早期就會死亡，證明GPX4基因與機體存活有重要關(guān)系[10]。GPX4分為核型、胞質(zhì)型、線粒體型，不同類型的GPX4分布于機體不同組織細胞的胞核、胞質(zhì)及線粒體中，GPX4可保護線粒體免受ROS刺激，防止線粒體凋亡，還能還原磷脂及膽固醇氫過氧化物，使機體免受氧化應(yīng)激損傷，防止心血管疾病及神經(jīng)退行性變發(fā)生[11]。賈忠偉等[12]發(fā)現(xiàn)GPX4在肺腺癌組織中的表達水平高于正常組織，Guerriero等[13]研究表明GPX4在肝癌組織中高表達，且表達水平與組織分級呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)GPX4在食管鱗癌組織中的表達水平明顯高于正常食管組織，GPX4在浸潤深度為外膜及外周器官組的陽性率為93.5%（29/31）明顯高于浸潤深度為黏膜層及肌層組63.1%（12/19），在淋巴結(jié)遠處轉(zhuǎn)移組中的陽性率為100%（21/21）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組68.9%（20/29），在臨床分期Ⅲ-Ⅳ期組的陽性率為94.1%（32/34）明顯高于Ⅰ-Ⅱ期組56.2%（9/16），此數(shù)據(jù)表明GPX4表達水平與食管癌臨床分期及惡性程度成正相關(guān)。

綜上所述，通過檢測GCLM和GPX4在食管鱗癌中的表達及其臨床病理特征間的關(guān)系，并對GCLM和GPX4表達水平間的相關(guān)性進行分析，提示Nrf2/ARE信號通路在食管癌的發(fā)展中起重要作用，Nrf2所激活的GCLM和GPX4與食管癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為食管癌檢測的標志物，為其臨床診斷提供參考價值。