黎夢(mèng)娟，朱禮明，霍俊男，張景波，施季森，成鐵龍*

(1.南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院沙漠林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，內(nèi)蒙古 磴口 015200；3.南京林業(yè)大學(xué)，林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037)

植物在整個(gè)生命周期中會(huì)遇到各種不利的非生物逆境脅迫，如土壤鹽分、干旱、高溫、低溫、低鉀等。植物感受到非生物脅迫后會(huì)產(chǎn)生一些生物反應(yīng)來(lái)避免傷害發(fā)生，而其中的關(guān)鍵在于對(duì)非生物脅迫的檢測(cè)[1]。鈣離子作為重要的第二信使，普遍存在于真核生物的細(xì)胞中，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)外界環(huán)境脅迫中起關(guān)鍵作用[2-4]。外界環(huán)境刺激，如土壤鹽分、干旱、低溫、激素、低鉀等都能引起細(xì)胞中游離的Ca2+濃度在時(shí)空上出現(xiàn)特異性的變化[5]。這種Ca2+信號(hào)變化會(huì)被鈣結(jié)合蛋白感知并傳遞給下游的靶蛋白，靶蛋白通過(guò)調(diào)控下游目的基因從而激活相應(yīng)的應(yīng)答途徑[6]。到目前為止，在高等植物中主要有鈣調(diào)蛋白(calmodulins, CaM)、類鈣調(diào)蛋白(calmodulin-like proteins, CML)、鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPK)、類鈣調(diào)磷酸酶B蛋白(calcineurin B-like proteins, CBL)這4種Ca2+感受器蛋白家族[7]。而鹽脅迫作為最常見(jiàn)的環(huán)境脅迫因子之一，引起植物的氧化脅迫[8]、離子脅迫[9]、滲透脅迫[10]，抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至可以導(dǎo)致植物的死亡。土壤鹽堿化問(wèn)題已經(jīng)成為全球性的生態(tài)環(huán)境與資源問(wèn)題，日益受到人們的重視[11]。

1998年CBL基因首次在擬南芥中被克隆出來(lái)[12]，由于與動(dòng)物的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B(CNB)和神經(jīng)元鈣傳感器(NCS)同源，由此被命名為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B亞基蛋白[12-13]。類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白CBL是一個(gè)多基因家族鈣離子感受器，可以檢測(cè)到鈣離子的時(shí)空變化。研究表明，CBL基因家族在不同植物中的數(shù)目是不等的，擬南芥、水稻均有10個(gè)[14]，茶樹(shù)有7個(gè)[15]。CBL通過(guò)其特異性靶蛋白絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶CIPK互作構(gòu)成CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)在植物應(yīng)答外界環(huán)境刺激中起重要作用[16]。

唐古特白刺(Nitrariatangutorum)是蒺藜科(Zygophyllaceae) 白刺屬(Nitraria)一種鹽生植物，為我國(guó)所特有，主要分布在河西走廊干旱鹽漬化地區(qū)，具有耐干旱、耐鹽堿、防風(fēng)固沙等特點(diǎn)[17]，在治理土壤荒漠化和鹽堿化中發(fā)揮著重要作用[18]。唐古特白刺含有大量的營(yíng)養(yǎng)成分和藥用成分，具有較高藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但是對(duì)唐古特白刺的研究主要集中在生理生化分析[19-20]、化學(xué)成分的提取[21]、優(yōu)良家系的選擇[22]上，而從分子水平上闡述其耐鹽機(jī)制的研究鮮見(jiàn)。本研究以唐古特白刺為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)CBL1、CBL2基因進(jìn)行克隆分析并研究其在鹽、干旱、冷脅迫條件下的表達(dá)情況，為探討唐古特白刺的耐鹽機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

將唐古特白刺種子用沙土于4 ℃下沙藏2～6個(gè)月，取出后用發(fā)芽盒萌發(fā)，待種子長(zhǎng)出兩片子葉時(shí)將其種到土壤中。種植土壤以V營(yíng)養(yǎng)土∶V珍珠巖∶V蛭石=5∶1∶1進(jìn)行配制，每隔4 d澆1次水。

種植白刺6周后，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)良好的唐古特白刺并隨機(jī)分成對(duì)照組和處理組，對(duì)照組正常用水進(jìn)行澆灌，鹽脅迫處理組以500 mmol/L NaCl溶液進(jìn)行澆灌，干旱脅迫處理組以300 mmol/L甘露醇液澆灌，每盆澆灌750 mL；冷脅迫處理組置于4 ℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理，每處理3次重復(fù)。分別在脅迫時(shí)間為0、1、3、6 h取唐古特白刺根、莖、葉片，用液氮速凍，于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 唐古特白刺總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

以唐古特白刺新鮮嫩葉為試驗(yàn)材料，用Bioteke RNA多糖多酚型植物試劑盒提取唐古特白刺總RNA，得到的總RNA用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。再參照HiScript? Ⅲ 1st Strand cDNA 反轉(zhuǎn)試劑盒(Vazyme)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA的合成體系為：總RNA 10 μL，10 × RT mix、HiScript III Enzyme mix各2 μL，Random hexamers 1 μL，RNase-free ddH2O 20 μL。反應(yīng)程序設(shè)置為：25 ℃ 5 min，37 ℃ 45 min，85 ℃ 5 s。為了盡量減少RNA酶的污染，進(jìn)行試驗(yàn)所需的研缽、槍頭、離心管等均用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的DEPC水浸泡且高壓滅菌后使用，總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄均在超凈臺(tái)內(nèi)操作。

1.3 唐古特白刺N(yùn)tCBL1、NtCBL2基因的克隆

根據(jù)南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已有的部分唐古特白刺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進(jìn)行同源基因比對(duì)后找出目的基因，使用Oligo 7.0設(shè)計(jì)特異性引物，將引物命名為NtCBL1-F、NtCBL1-R和NtCBL2-F、NtCBL2-R，如表1所示。以反轉(zhuǎn)得到的cDNA為模板，目的CBL1、CBL2片段進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段，切膠回收后的純化產(chǎn)物與pMD19-T Vector連接，再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選得到的陽(yáng)性克隆菌液送到公司測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.4 CBL基因的生物信息學(xué)分析

在NCBI中用BLAST(http：//www.NCBI.nlm.nih.gov)搜索NtCBL1、NtCBL2基因所編碼的氨基酸同源的氨基酸序列；通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)克隆得到的NtCBL1、NtCBL2基因所編碼的氨基酸序列和這些同源序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析；用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域；通過(guò)網(wǎng)站 http://web.expasy.org/protparam/分析該蛋白的理化性質(zhì)；利用Oligo7和NCBI在線軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物；利用MEGAX中的鄰接法(neighbor-joining,NJ)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.5 唐古特白刺N(yùn)tCBL1、NtCBL2基因的亞細(xì)胞定位

利用XbaI與BamhI酶切位點(diǎn)對(duì)pJIT166質(zhì)粒對(duì)進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系為PJIT166質(zhì)粒 3 μL，10×CutSmart Buffer 5 μL，XbaI、BamHⅠ各 1 μL，ddH2O 40 μL。反應(yīng)條件為37 ℃酶切1 h，雙Z酶切產(chǎn)物用切膠回收試劑盒進(jìn)行回收。設(shè)計(jì)帶XbaⅠ與BamhI酶切位點(diǎn)的引物gNtCBL1-F、gNtCBL1-R和gNtCBL2-F、gNtCBL2-R(表1)，其中引物上的小寫(xiě)字母為載體上的序列。利用同源重組的方法構(gòu)建pJIT166-NtCBL1-GFP、pJIT166-NtCBL2-GFP融合表達(dá)載體，以哥倫比亞Col擬南芥葉片制備原生質(zhì)體，參照PEG介導(dǎo)法[23]進(jìn)行目的基因的亞細(xì)胞定位。

1.6 唐古特白刺N(yùn)tCBL1、NtCBL2基因的表達(dá)分析

以不同鹽脅迫、干旱脅迫、冷脅迫條件下不同時(shí)間處理的唐古特白刺葉為材料，提取RNA并用HiScript? Ⅲ 1st Strand cDNA for qPCR(+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)試劑盒(Vazyme)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在NBCI在線設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，NtCBL1引物為qCBL1-F、qCBL1-R，NtCBL2引物為qCBL2-F、qCBL2-R，內(nèi)參引物為β-Actin-F、β-Actin-R(表1)，參照AceQ qPCR SYBR Green mix(Vazyme)進(jìn)行熒光定量分析。采用2-ΔΔCT[24]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)結(jié)果利用SPSS進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 唐古特白刺N(yùn)tCBL1、NtCBL2基因的克隆

以唐古特白刺葉片cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物NtCBL1-F、NtCBL1-R和NtCBL2-F、NtCBL2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期條帶大小一致的擴(kuò)增條帶(圖1)。NtCBL1基因cDNA編碼區(qū)為642 bp，而NtCBL2基因cDNA編碼區(qū)為681 bp。

M. DL2000 DNA marker; 1、2. 對(duì)照 control。圖1 唐古特白刺N(yùn)tCBL1、NtCBL2基因的PCR 擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.1 PCR amplification of NtCBL1 and NtCBL2 gene

2.2 唐古特白刺N(yùn)tCBL1、NtCBL2序列的參數(shù)分析

利用 http://web.expasy.org/網(wǎng)址中的ProtParam 工具對(duì)編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，得出NtCBL1蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為52.77 ku；理論等電點(diǎn)(pI) 5.21，分子式為C1 971H3 302N642O836S106。脂肪系數(shù)為 30.37，平均親水系數(shù)為0.657，預(yù)測(cè)其為疏水蛋白。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為32.78，被認(rèn)定為穩(wěn)定性蛋白。

鑒于Hadoop平臺(tái)下作業(yè)調(diào)度算法在Reduce任務(wù)調(diào)度方面的不足，本文提出了一種新的任務(wù)調(diào)度算法，其基本思想在于選擇系統(tǒng)中的最優(yōu)節(jié)點(diǎn)，將特定的Reduce任務(wù)調(diào)度到最優(yōu)節(jié)點(diǎn)上，從而減少任務(wù)的中間數(shù)據(jù)傳輸時(shí)間，省去對(duì)數(shù)據(jù)中心帶寬資源的占用。其中最優(yōu)節(jié)點(diǎn)是指集群中通過(guò)網(wǎng)絡(luò)鏈路傳輸Map階段中間數(shù)據(jù)時(shí)經(jīng)過(guò)的跳數(shù)最少的節(jié)點(diǎn)。

NtCBL2蛋白質(zhì)分子質(zhì)量26.10 ku；理論理論等電點(diǎn)(pI) 4.82，分子式為C1 179H1 832N298O356S7。脂肪系數(shù)為45.58，平均親水系數(shù)為-0.243，預(yù)測(cè)其為親水蛋白。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為92.30，被認(rèn)定為不穩(wěn)定性蛋白。

將NtCBL1、NtCBL2的CDS序列提交到NCBI的ORF finder在線翻譯工具，可知NtCBL1翻譯213個(gè)氨基酸，NtCBL2翻譯226個(gè)氨基酸。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件分析，結(jié)果顯示，NtCBL1、NtCBL2蛋白均具有3個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)域，含有Ca2+binding位點(diǎn)，是鈣離子結(jié)合蛋白，可進(jìn)行鈣信號(hào)傳導(dǎo)(圖2A、2B)。NtCBL1和NtCBL2蛋白的第1個(gè)和第2個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)域距離9個(gè)氨基酸，而第2個(gè)和第3個(gè)的距離均為16個(gè)氨基酸。

灰色區(qū)域代表EF手型結(jié)構(gòu)域，aa為氨基酸單位。The gray region represents EF hand domain, aa is amino acid unit.圖2 NtCBL1蛋白(A)和NtCBL2蛋白(B)蛋白 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.2 The prediction for conserved domains of NtCBL1 protein(A) and NtCBL2 protein(B)

2.3 NtCBL1、NtCBL2氨基酸序列的同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

在NCBI上下載其他CBL1蛋白序列，再用DNAMAN軟件對(duì)NtCBL1、NtCBL2蛋白與其他植物的CBL1、NtCBL2蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果(圖3A)顯示，NtCBL1蛋白與其他蛋白的同源相似性為80.0%～90.0%。其中，NtCBL1蛋白與毛果楊(Populustrichocarpa)PtCBL1蛋白的同源相似性最高，達(dá)到88.3%，與擬南芥(Arabidopsisthaliana)的則為83.1%。這些結(jié)果表明，NtCBL1所編碼的蛋白序列與其他植物的同源性較高且它們均含有豆蔻酰化結(jié)構(gòu)域(MGXXXS/T)。比對(duì)NtCBL2蛋白與其他植物蛋白序列，結(jié)果顯示，NtCBL2蛋白與其他植物蛋白的同源相似性均高于90%且與陸地錦(Gossypiumhirsutum)、杜梨(Pyrusbetulifolia)高達(dá)93.81%(圖3B)。

A.NtCBL1與其他植物CBL1蛋白的多序列比對(duì)分析multiple sequence alignment of NtCBL1 and CBL1 proteins of other plants;AAC26008.1.擬南芥Arabidopsis thaliana；ABO43660.1.毛果楊Populus trichocarpa；AXM42381.1.木薯Manihot esculenta；KAF4362542.1.大麻Cannabis sativa；NP_001239047.1.番茄Solanum lycopersicum；ABC67906.1.胡楊Populus euphratica。B.NtCBL1與其他植物CBL1蛋白的多序列比對(duì)分析multiple sequence alignment of NtCBL2 and CBL2 proteins of other plants；ABW06389.1.陸地棉Gossypium hirsutum；AGM15885.1.杜梨Pyrus betulifolia；ABJ09704.1.胡楊Populus euphratica；AFK64728.1.百合Lilium longiflorum；ABO43661.1.毛果楊Populus trichocarpa。圖3 NtCBL與其他植物CBL蛋白的多序列比對(duì)分析Fig.3 The multiple sequence alignment of NtCBL and CBL proteins from other plants

用MEGA-X軟件，采用鄰接法(neighbor joining, NJ)對(duì)氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，Bootstrap設(shè)置為1 000，結(jié)果如圖4所示。可見(jiàn)進(jìn)化樹(shù)主要聚類成兩大支，唐古特白刺N(yùn)tCBL1和擬南芥AtCBL1、AtCBL9的同源性最高，它們的親緣關(guān)系最近，而唐古特白刺N(yùn)tCBL2和擬南芥AtCBL2、AtCBL3聚類于同一發(fā)育分支上，表明它們的同源一致性較高。

圖4 CBL進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 The phylogenetic tree analysis of CBL

綜上表明，所克隆得到的兩個(gè)基因?qū)貱BL基因家族，編碼唐古特白刺類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白。

2.4 唐古特白刺基因的亞細(xì)胞定位

圖5 轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)的亞細(xì)胞定位結(jié)果Fig.5 Subcellular location results of transformation of Arabidopsis protoplasts

由圖5可知，對(duì)照組PJIT166的GFP分布于整個(gè)原生質(zhì)體中，經(jīng)過(guò)明場(chǎng)和熒光場(chǎng)疊加一起表明，空載PJIT166在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜上都有表達(dá)。而NtCBL1、NtCBL2主要在質(zhì)膜上發(fā)出熒光，說(shuō)明這兩個(gè)基因翻譯的蛋白可能在質(zhì)膜上發(fā)揮作用。

2.5 唐古特白刺基因的表達(dá)分析

為了研究NtCBL1、NtCBL2在不同脅迫條件下的表達(dá)情況，分別用500 mmol/L NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理、300 mmol/L的甘露醇進(jìn)行干旱脅迫處理以及4 ℃的冷脅迫處理。以β-Actin為內(nèi)參基因，根據(jù)NtCBL1、NtCBL2基因序列設(shè)計(jì)qCBL1-F/R、qCBL2-F/R熒光引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 在不同脅迫條件下NtCBL基因表達(dá)分析Fig.6 Expression profiles of NtCBL gene under different stress

圖6顯示，在未處理前NtCBL1基因在莖中的表達(dá)量最高，幾乎為葉片中的2倍，在根中的表達(dá)量最低。同樣地，NtCBL2基因在莖中的表達(dá)量最高，其次是在根中，而在葉片中的表達(dá)量最低。500 mmol/L鹽脅迫處理下，NtCBL1基因的表達(dá)發(fā)生了變化，根、莖、葉內(nèi)基因表達(dá)量在3 h均達(dá)到最高值，相比未處理前根中上調(diào)了1.56倍，在莖中上調(diào)了1.78倍，而在葉片中的上調(diào)倍數(shù)最為明顯，為2.94倍。NtCBL2在鹽脅迫下雖然存在波動(dòng)，但是沒(méi)有顯著性差異，相比處理前，在1 h時(shí)上調(diào)得最為顯著，在葉片內(nèi)表達(dá)量也僅達(dá)到其對(duì)照的1.29倍。干旱脅迫下，NtCBL1基因在莖、葉內(nèi)都上調(diào)表達(dá)，但是上升的倍數(shù)不是很明顯，最高上調(diào)情況發(fā)生在處理1 h的葉片內(nèi)，上調(diào)倍數(shù)為1.44。但是NtCBL2基因在干旱處理下上升和降低都沒(méi)有顯著性差異。在4 ℃冷處理下，NtCBL2基因在根、葉中顯示出先升高后下降的趨勢(shì)，而在莖中也顯示相同的趨勢(shì)，但是變化不是很明顯；而NtCBL2基因在葉片中整體上調(diào)表達(dá)，在1 h是達(dá)到最高，為對(duì)照的1.59倍。

3 討 論

CBL-CIPK響應(yīng)多種逆境脅迫，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。CBL-CIPK途徑最開(kāi)始是在鹽敏感的擬南芥突變體缺失基因sos3(cbl4)的分離鑒定中被發(fā)現(xiàn)的[11]，大多數(shù)CBL蛋白定位于細(xì)胞膜，因此，大多CBL-CIPK途徑在很大程度上與細(xì)胞膜相關(guān)[25]。對(duì)鹽生植物唐古特白刺進(jìn)行CBL基因克隆，獲得NtCBL1基因cDNA編碼區(qū)為642 bp，共編碼213個(gè)氨基酸殘基。NtCBL2基因cDNA編碼區(qū)為681 bp，共編碼226個(gè)氨基酸殘基。結(jié)構(gòu)分析表明，NtCBL1、NtCBL2基因有EH手型保守結(jié)構(gòu)域，這是與Ca2+結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。NtCBL1蛋白與其他植物的CBL1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果NtCBL1蛋白與毛白楊、大麻、擬南芥、木薯的同源相似性較高。其中，NtCBL1蛋白與毛果楊PtCBL1蛋白的同源相似性最高，說(shuō)明NtCBL1基因可能與PtCBL1基因在功能上有相似之處。且它們均含有豆蔻?；Y(jié)構(gòu)域(MGXXXS/T)[26]，在擬南芥植物細(xì)胞中該基序介導(dǎo)的膜結(jié)合和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[27]，為CBL蛋白第1亞族成員[13]。NtCBL2蛋白與其他植物的CBL2蛋白的氨基酸序列也具有較高的同源相似性，同源相似性均在90%以上。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明了NtCBL1、NtCBL2蛋白在質(zhì)膜上表達(dá)，它們可做膜結(jié)合蛋白在細(xì)胞中發(fā)揮作用。

到目前為止，CBL1基因是擬南芥CBL基因家族亦是CBL基因家族中研究得最廣泛的基因。CBL1基因在鹽、干旱、低溫、低鉀中的作用已在模式植物和其他作物中被探究[1, 28]。比較野生型擬南芥和cbl1突變體中CIPK7的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)CIPK7通過(guò)與CBL1的相互作用在冷反應(yīng)中發(fā)揮功能[29]。此外，過(guò)表達(dá)CBL1的植株表現(xiàn)出對(duì)鹽和干旱的耐性增強(qiáng)，但對(duì)低溫的耐性降低[30]。而在鹽脅迫下杜梨CBL1在根、莖、葉中高表達(dá)[31]。本研究結(jié)果表明NtCBL1基因受鹽脅迫處理的誘導(dǎo)，在根莖葉中上調(diào)表達(dá)，在脅迫3 h時(shí)葉片上調(diào)達(dá)到最高值，NtCBL1基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組提高了2.94倍，推測(cè)NtCBL1基因能夠提高唐古特白刺高鹽條件下的耐受能力。而干旱脅迫下，NtCBL1基因有一定的上調(diào)現(xiàn)象，最高上調(diào)表達(dá)了1.44倍，可能NtCBL1基因在唐古特白刺干旱耐受上起到一定的作用。在4 ℃冷處理下，NtCBL1基因僅在葉片中較為明顯的上調(diào)表達(dá)。相對(duì)于CBL1基因來(lái)說(shuō)，對(duì)CBL2基因的研究較少。Nurazzaman[32]將煙草NsylCBL2轉(zhuǎn)入擬南芥的研究中，發(fā)現(xiàn)NsylCBL2可能不受鹽與鎂的信號(hào)誘導(dǎo)。對(duì)胡楊進(jìn)行鹽脅迫處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)葉片中PeCBL1、PeCBL2均上調(diào)表達(dá)[33]。在對(duì)馬尾松PmCBL3基因的研究中發(fā)現(xiàn)，PmCBL3響應(yīng)干旱脅迫[34]。這些均表明了同一基因在不同的物種中可能有相似的功能，也可能有差異。而筆者在研究唐古特白刺N(yùn)tCBL2基因在鹽脅迫、干旱脅迫下的表達(dá)特征時(shí)，發(fā)現(xiàn)NtCBL2基因的變化不明顯，可能其在鹽脅迫、干旱脅迫下的作用不明顯。而在4 ℃冷脅迫下，NtCBL2基因在葉片中有一定的上調(diào)表達(dá)，推測(cè)其在冷脅迫響應(yīng)中發(fā)揮一定的作用。

目前，對(duì)CBL家族的分析研究主要集中于擬南芥、水稻和玉米等模式植物中[16]，對(duì)具有強(qiáng)抗鹽性的唐古特白刺等木本植物研究較少。唐古特白刺對(duì)高鹽、干旱、低溫等非生物脅迫具有極強(qiáng)的耐受性，是研究環(huán)境脅迫的理想材料。本研究從唐古特白刺中克隆出NtCBL1、NtCBL2基因，研究了鹽脅迫條件下的基因表達(dá)模式，為唐古特白刺的耐鹽分子機(jī)制研究奠定了理論基礎(chǔ)。