陳興彬，徐海寧，肖復(fù)明*，孫世武，婁永峰，鄒元熹，徐小強(qiáng)

(1.江西省林業(yè)科學(xué)院,江西省植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330032； 2.吉安市青原區(qū)白云山林場(chǎng)，江西 吉安 343000；3. 吉安市青原區(qū)林業(yè)局，江西 吉安 343000)

種子園是林木提供良種的主要形式，其目標(biāo)是穩(wěn)定提供遺傳改良的種子。種子園既要有較高的遺傳增益，又要保持較寬的遺傳基礎(chǔ)，才能確保子代具有較強(qiáng)的適應(yīng)性[1]。同時(shí)，對(duì)種子園交配參數(shù)進(jìn)行深入研究，可以了解種子園的花粉污染率、隨機(jī)交配狀況和自交水平等[2]，這對(duì)種子園的經(jīng)營(yíng)和管理有著重要意義。

近交和親本貢獻(xiàn)率是重要的交配參數(shù)。近交，特別是自交，常常導(dǎo)致種子園種子產(chǎn)量的下降和種子的生長(zhǎng)不良[3]。自交和外界花粉污染能使種子園的遺傳增益減少50%以上[4]。海岸松(Pinuspinaster)子代試驗(yàn)林實(shí)驗(yàn)表明，近交可使樹(shù)高降低27%，胸徑減少37%，親本繁殖力降低89%[5]。同時(shí)，不均等的親本貢獻(xiàn)不僅降低子代的育種值，還可能降低子代的遺傳多樣性和適應(yīng)性[6]。

杉木[Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hook]是我國(guó)南方最重要的用材樹(shù)種之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。杉木種源間存在顯著的遺傳差異，陳山紅心杉是江西特有杉木優(yōu)良種源[7]。我國(guó)自20世紀(jì)60年代開(kāi)始構(gòu)建杉木1代無(wú)性系種子園以來(lái)，杉木種子園的營(yíng)建、種子產(chǎn)量和質(zhì)量提升等方面取得了顯著進(jìn)步，并在生產(chǎn)上取得了大量成果[8-9]。然而，杉木種子園交配參數(shù)還鮮見(jiàn)研究報(bào)道。筆者以陳山紅心杉1.5代種子園為材料，比較種子園親子代遺傳多樣性的差異，并對(duì)種子園子代進(jìn)行父本分析，以期為紅心杉種子園良種生產(chǎn)和經(jīng)營(yíng)管理提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究材料取自江西省青原區(qū)白云山林場(chǎng)陳山紅心杉1.5代種子園和其子代測(cè)定林。由于杉木的種子成苗率不高，以測(cè)定林為材料進(jìn)行子代父本分析研究，對(duì)種子園的經(jīng)營(yíng)和管理具有指導(dǎo)意義。20世紀(jì)90年代中期，科研人員在陳山林區(qū)的杉木人工林與天然林分中選出陳山紅心杉優(yōu)樹(shù)53株，于1998年?duì)I建成陳山紅心杉1代種子園，2000年種子園開(kāi)始生產(chǎn)種子。2001年進(jìn)行了單系采種，并在贛東北、贛中、贛南進(jìn)行子代測(cè)定工作。根據(jù)子代測(cè)定結(jié)果，選出32個(gè)生長(zhǎng)快、材性更加優(yōu)良的無(wú)性系用于1.5代種子園的營(yíng)建。

本試驗(yàn)中的1.5代種子園于2006年4月嫁接建成，面積11 hm2，共32個(gè)無(wú)性系，小區(qū)內(nèi)無(wú)性系配置以隨機(jī)與調(diào)整相結(jié)合定植，株行距為 4 m×4 m，同一無(wú)性系不同個(gè)體間距20 m以上。2017年秋，分單系采種，2018年春育苗，2019年春在白云山林場(chǎng)營(yíng)造子代測(cè)定林。測(cè)定林采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，5株單行小區(qū)，10次重復(fù)，以普通杉木苗為對(duì)照。2020年7月，隨機(jī)選擇測(cè)定林的14個(gè)家系，采集前7個(gè)重復(fù)單株的針葉，每個(gè)家系采集子代數(shù)量30～35個(gè)不等，共計(jì)459個(gè)子代個(gè)體，同時(shí)采集種子園32個(gè)親本的針葉，一并帶回實(shí)驗(yàn)室放入-70°冰箱中備用。采用改良CTAB法提取基因組DNA。

1.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

利用12對(duì)SSR引物對(duì)親本和子代的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10]，所得擴(kuò)增產(chǎn)物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 S，56 ℃退火30 S，72 ℃延伸45 S，共進(jìn)行30個(gè)反應(yīng)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Gene Marker 2.2.0分析毛細(xì)管電泳結(jié)果，得到基因型數(shù)據(jù)。利用Popgen 1.32計(jì)算親本和子代群體的遺傳多樣性參數(shù)。參數(shù)包括等位基因數(shù)(number of allele，Na)、有效等位基因數(shù)(number of effective allele，Ne)、Shannon’s信息指數(shù)(Shannon’s information index，I)、觀測(cè)雜合度(observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)和固定指數(shù)(fixed index,F,F=1-Ho/He)。應(yīng)用混合交配模型MLTR 3.4估計(jì)多位點(diǎn)異交率(multilocus outcrossing rate，tm)、單位點(diǎn)異交率(singlelocus outcrossing rate，ts)、雙親近交指數(shù)(biparental inbreeding coefficient，tm-ts，數(shù)值越大表示父母本個(gè)體間親緣關(guān)系越近)、多位點(diǎn)父本相關(guān)(biparental inbreeding，Rp(m))，單位點(diǎn)父本相關(guān)(multilocus correlation of paternity，Rp(s))[11]。Rp是父本相關(guān)性的估計(jì)，表示家系中異交子代是全同胞的比例。根據(jù)Nep=1/Rp(m)，計(jì)算有效花粉供體數(shù)[12]。用軟件Cervus 3.0進(jìn)行子代父本分析[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子園親本與子代遺傳多樣性分析

12對(duì)SSR引物在32個(gè)親本中檢測(cè)到的等位基因數(shù)(Na)范圍為3～7，平均為4.41個(gè)，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為2.330，其中LX-18位點(diǎn)的Na和Ne最大，分別為7和3.457(表1)。親本群體的平均Shannon’s信息指數(shù)為0.992，實(shí)際觀察雜合度(Ho)和期望雜合度(He)的均值分別為0.571和0.557，觀測(cè)雜合度高于期望值雜合度。在包含459個(gè)體的子代群體中，12對(duì)引物分別檢測(cè)到4～11個(gè)等位基因，平均為6.50個(gè)，較親本群體高出2.09。子代群體的Ne為1.680～3.916，平均為2.306，稍低于親本群體。子代群體的Shannon’s信息指數(shù)為1.004，說(shuō)明子代群體中遺傳多樣性略高于親本群體。子代群體平均Ho和He分別為0.525和0.538，相對(duì)于親本群體略有減少，說(shuō)明子代群體的雜合個(gè)體的比率和基因分布的均勻程度有所降低。子代群體的固定指數(shù)(F)為0.024，說(shuō)明存在純合子過(guò)量現(xiàn)象。在分析的12個(gè)位點(diǎn)中，有11個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到1～5個(gè)子代特有而親本沒(méi)有的等位基因。

表1 親子群體的遺傳多樣性

2.2 種子園親本交配參數(shù)分析

多位點(diǎn)交配系統(tǒng)分析表明，陳山紅心杉種子園總的多位點(diǎn)異交率(tm)是1.012±0.075，單位點(diǎn)異交率(ts)為0.991±0.042，說(shuō)明種子園異交率較高。雙親近交指數(shù)(tm-ts)為0.021±0.087，表明種子園無(wú)性系間近交水平比較低。多位點(diǎn)父本相關(guān)性[Rp(m)]和單位點(diǎn)父本相關(guān)性[Rp(s)]分別為0.128±0.019和-0.016±0.079，單位點(diǎn)和多位點(diǎn)父本相關(guān)性的差值Rp(s)-Rp(m)=-0.144<0，表明親本間沒(méi)有明顯的近親關(guān)系。種子園的有效花粉供體數(shù)目(Nep)為7.81。

對(duì)14個(gè)家系分別進(jìn)行交配系統(tǒng)分析(表2)，家系間的多位點(diǎn)異交率(tm)變化幅度為0.938～1.200，有10個(gè)家系的多位點(diǎn)異交率為1.200，其余4個(gè)家系的多位點(diǎn)異交率為0.938～1.114。近交指數(shù)(tm-ts)變化幅度為-0.127～0.150，其中5、8、27、29、51號(hào)家系近交指數(shù)等于或小于零，其余家系的近交系數(shù)都大于零，說(shuō)明部分家系存在近交現(xiàn)象。

表2 14個(gè)家系的異交率

2.3 子代父本分析

對(duì)14個(gè)家系的459個(gè)子代進(jìn)行父本分析，在80%可信度下推斷出325個(gè)子代的父本，占子代總數(shù)的70.8%(表3)。子代的親本均不是同一無(wú)性系，說(shuō)明種子園無(wú)自交現(xiàn)象。各家系子代確定父本的比率不一致，41號(hào)家系子代確定父本的比率最高，為93.9%，其他家系子代確定父本比率為54.3%～90.9%。

表3 14個(gè)家系的子代父本來(lái)源分析

對(duì)325個(gè)子代的父本來(lái)源進(jìn)行分析，可以明確每個(gè)家系子代的父本組成(圖1)。其中，8號(hào)家系確定父本的30個(gè)子代中，16個(gè)子代的父本為20號(hào)無(wú)性系，占家系子代總數(shù)的53.3%；12號(hào)家系確定父本的26個(gè)子代中，12個(gè)子代的父本為22號(hào)無(wú)性系，占家系子代總數(shù)的46.2%，說(shuō)明無(wú)性系間授粉親和性不同。在32個(gè)潛在無(wú)性系中，有26個(gè)無(wú)性系提供了有效花粉，其中父本貢獻(xiàn)率最高的是22號(hào)無(wú)性系和29號(hào)無(wú)性系，各為33個(gè)子代提供了花粉，其貢獻(xiàn)率均為10.2%，其他無(wú)性系的父本貢獻(xiàn)率為0.3%～8.9%。父本貢獻(xiàn)率最高的前11個(gè)無(wú)性系共計(jì)產(chǎn)生了70.2%的子代。

圖1 子代父本來(lái)源分析Fig.1 Paternal origin of offspring

3 討 論

遺傳多樣性包括了一個(gè)物種所有個(gè)體間遺傳變異的總和，是群體生存和發(fā)展的前提[14]。對(duì)遺傳資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，有利于育種策略的制定和資源的科學(xué)管理。種子園所產(chǎn)種子保持一定的遺傳多樣性，有利于所造林分適應(yīng)栽培環(huán)境。本研究中陳山紅心杉1.5代種子園親本和子代觀測(cè)雜合度(Ho)分別為0.525和 0.571，說(shuō)明子代群體中實(shí)際雜合單株比率較親本有所下降，但差異不大。由于親本間的近交，使得子代雜合性低于親本。親本群體和子代群體的Shannon’s信息指數(shù)(I)分別為0.992和1.004，說(shuō)明子代群體的遺傳多樣性略高于親本群體。在馬尾松(Pinusmassoniana)種子園[15]、華北落葉松(Larixgmeliniivar.principis-rupprechtii)2代種子園[16]均發(fā)現(xiàn)種子園子代群體的遺傳多樣與親本群體差異不顯著。本研究的結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致，即經(jīng)過(guò)1代的自由授粉，種子園子代群體的遺傳多樣性并沒(méi)有降低。

異交植物中，近交和自交會(huì)使有害隱性基因純合，從而使自交子代易出現(xiàn)生長(zhǎng)不良、抗性差和易致死等現(xiàn)象[17]。風(fēng)媒傳粉的針葉樹(shù)種子園一般具有較高的異交率，如，馬尾松的異交率為109.8%[18]，海岸松的異交率為90.1%[3]，日本柳杉 (Cryptomeriajaponica) 的異交率為94.4%[19]。本研究表明，陳山紅心杉種子園子代測(cè)定林沒(méi)有自交子代，多位點(diǎn)異交率(tm)為1.012，說(shuō)明種子園具有較高的異交水平。異交率高可能與所用的實(shí)驗(yàn)材料有關(guān)，本研究材料為子代測(cè)定林，杉木自交導(dǎo)致種子敗育，成苗率極低[20]，自交子代生長(zhǎng)較弱，可能在種子形成期和幼苗期已經(jīng)被淘汰[21]，因此沒(méi)有發(fā)現(xiàn)自交子代。陳山紅心杉種子園具有高的異交率，但仍存在少量的近交現(xiàn)象。雙親近交指數(shù)(tm-ts)為0.021，表明無(wú)性系間親緣關(guān)系較低，只有低水平的近交發(fā)生，與得出的較高的有效花粉供體數(shù)目(Nep=7.81)相一致。無(wú)性系間不同的花期、花量以及選擇受精均可導(dǎo)致種子園非隨機(jī)交配，造成近交的發(fā)生[22]。

無(wú)性系提供均等的生殖貢獻(xiàn)有助于提高種子園種子的遺傳品質(zhì)，因此，大量樹(shù)種開(kāi)展了父本貢獻(xiàn)率研究[23]。云杉(Piceaasperata)種子園多年研究表明，平均10.4%無(wú)性系生產(chǎn)了種子園50%的子代[24]。日本落葉松(Larixkaempferi)種子園研究表明，無(wú)性系的父本貢獻(xiàn)率為0～12.4%，50%的無(wú)性系提供了91.7%子代的花粉[25]。本研究在80%可信度下推斷出325個(gè)子代的父本，在32個(gè)潛在父本無(wú)性系中，有26個(gè)無(wú)性系提供了有效花粉，無(wú)性系的父本貢獻(xiàn)率為0～10.2%，父本貢獻(xiàn)率最高的前11個(gè)無(wú)性系共產(chǎn)生70.2%的子代。因此，驗(yàn)證了前人研究得出的大部分無(wú)性系種子園普遍存在非隨機(jī)交配現(xiàn)象[26]。該種子園花期物候觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，無(wú)性系間花期、花量均存在較大差異，無(wú)性系間生殖能力的差異可能是父本貢獻(xiàn)率差異大的原因之一。陳山紅心杉不同無(wú)性系間還存在授粉偏好性，如，8號(hào)家系確定父本的30個(gè)子代中，有16個(gè)子代的父本為20號(hào)無(wú)性系；12號(hào)家系確定父本的26個(gè)子代中，有12個(gè)子代的父本為22號(hào)無(wú)性系。下一步需研究親和力高的無(wú)性系育種值狀況，新建種子園時(shí)，通過(guò)增加親和力和育種值均高無(wú)性系的數(shù)量，適當(dāng)減少親和力高，但育種值低的無(wú)性系數(shù)量，以建設(shè)高生產(chǎn)力紅心杉無(wú)性系種子園。