夏夢(mèng)雷，楊 帆，陸 鍇，王 頔，鄭 宇，王 敏

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

高通量測(cè)序技術(shù)是當(dāng)今基因組學(xué)研究中最為重要的方法之一，是將脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）或者互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）隨機(jī)片段化、加接頭，制備測(cè)序文庫(kù)，通過(guò)對(duì)文庫(kù)中數(shù)以萬(wàn)計(jì)的基因進(jìn)行延伸反應(yīng)，檢測(cè)對(duì)應(yīng)的信號(hào)，最終獲取序列信息，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，高通量測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步為傳統(tǒng)發(fā)酵食品中菌群的研究提供了重要的參考。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品具有悠久的歷史，且種類繁多，因其獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)而深受大眾歡迎。傳統(tǒng)食品最大的特點(diǎn)就是區(qū)域性差異，即在復(fù)雜的地理環(huán)境和氣候條件不斷創(chuàng)新發(fā)展形成[1-2]。發(fā)酵過(guò)程一般來(lái)說(shuō)是在常溫常壓下進(jìn)行的生物化學(xué)反應(yīng)，生產(chǎn)條件簡(jiǎn)單。傳統(tǒng)發(fā)酵食品已成為中國(guó)食品產(chǎn)業(yè)中不可或缺的組成，近年來(lái)隨著國(guó)內(nèi)外發(fā)酵食品工業(yè)化水平的逐年提高，傳統(tǒng)發(fā)酵食品產(chǎn)品結(jié)構(gòu)持續(xù)優(yōu)化，中高端產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)，現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)已成為傳統(tǒng)發(fā)酵食品企業(yè)紛紛借力的重要支撐[3]。

一般來(lái)說(shuō)，利用微生物的作用而制得的食品都可稱之為發(fā)酵食品，其自然接種的生產(chǎn)方式造就了微生物群落的復(fù)雜性和多樣性[4-5]。深入理解發(fā)酵機(jī)制，必須對(duì)微生物的代謝機(jī)制進(jìn)行研究[6-7]。傳統(tǒng)發(fā)酵食品（如食醋、醬油、白酒等）涉及到的菌種多、菌群產(chǎn)物復(fù)雜，傳統(tǒng)方法對(duì)菌群的分離純化培養(yǎng)會(huì)脫離原始的菌群環(huán)境，使分析結(jié)果產(chǎn)生偏差，利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)可以避免此現(xiàn)象的發(fā)生，同時(shí)，食品發(fā)酵的相關(guān)研究主要停留在產(chǎn)品和工藝的描述上，而對(duì)于大部分食品發(fā)酵背后的生化原理和微生物菌群的代謝機(jī)理研究甚淺。隨著高通量測(cè)序、宏基因組學(xué)等技術(shù)的快速發(fā)展，系統(tǒng)分析傳統(tǒng)發(fā)酵食品的風(fēng)味特征、功能成分和菌群結(jié)構(gòu)成為傳統(tǒng)釀造食品研究的主流方向[8-11]。這些研究的不斷深入，對(duì)促進(jìn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的科技創(chuàng)新、產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)揮著重要的作用。

本文聚焦以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction，RTFQPCR）、宏基因組測(cè)序、宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)榇淼默F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，綜述了其在國(guó)內(nèi)外傳統(tǒng)發(fā)酵食品功能微生物菌群研究中的最新進(jìn)展，以期為傳統(tǒng)發(fā)酵食品中功能微生物的研究提供參考依據(jù)。

1 PCR-DGGE技術(shù)

PCR-DGGE技術(shù)能夠快速分析微生物的物種多樣性，是分析微生物多樣性和鑒定不同地區(qū)微生物群落的有效工具。與依賴培養(yǎng)的方法相比，PCR-DGGE方法直接從樣品中提取DNA，分析速度更快，能反映樣品中的整個(gè)微生物群落[12]，因此被廣泛應(yīng)用在微生物生態(tài)學(xué)[13]和食品微生物學(xué)[14]等領(lǐng)域。

PCR-DGGE技術(shù)對(duì)微生物的分析如圖1所示，主要包括三個(gè)步驟：①核酸提取；②目標(biāo)序列的PCR擴(kuò)增；③序列對(duì)比分析。總DNA的提取是整個(gè)分析過(guò)程的基礎(chǔ)，是否能獲取樣品優(yōu)質(zhì)的總DNA決定了分析的可能性。DGGE是在聚丙烯酰胺凝膠的基礎(chǔ)上加入甲酰胺和尿素兩種變性劑，當(dāng)泳道與DNA變性所需變性劑濃度一致的凝膠濃度位置時(shí)，導(dǎo)致雙鏈部分變性。理想情況下，群體聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物中的每個(gè)獨(dú)特序列將在凝膠中的不同位點(diǎn)部分變性，從而得到高效分離[15-16]。

圖1 PCR-DGGE技術(shù)分析微生物菌群Fig.1 Analysis of microbial community by PCR-DGGE

PCR-DGGE技術(shù)可以對(duì)生態(tài)樣品中微生物菌群的構(gòu)成和動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)在較短時(shí)間內(nèi)做出相對(duì)客觀的評(píng)價(jià)，COCOLIN L等[17]將PCR-DGGE技術(shù)初步應(yīng)用于意大利發(fā)酵腸發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群動(dòng)力學(xué)研究，證實(shí)了發(fā)酵腸成熟早期的優(yōu)勢(shì)菌是乳酸菌。而彭?xiàng)畹萚18]為了探究四川麩醋和傳統(tǒng)豆醬中的菌群，利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)其中的微生物群落多樣性進(jìn)行了探究。左麗麗等[19]采用PCR-DGGE技術(shù)分析吉林市傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的多樣性，結(jié)果表明，豆醬發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌種類較為豐富，其中乳酸菌是發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)豆醬的風(fēng)味起主要作用。張文學(xué)等[20]對(duì)白酒窖池中的糟醅樣品進(jìn)行了DGGE分析，并結(jié)合16S rDNA同源性比較，揭示了白酒初步發(fā)酵時(shí)期窖池的糟醅中微生物多樣性的分布規(guī)律，并鑒定和篩選出主要優(yōu)勢(shì)菌，為掌握中國(guó)濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌類微生物區(qū)系的形成和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律提供了理論依據(jù)。

PCR-DGGE技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)突出，特別是在傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的地方，此技術(shù)可以大大縮短樣品的分析時(shí)間，同時(shí)不依賴于微生物培養(yǎng)過(guò)程而將環(huán)境樣品中大部分不可培養(yǎng)的微生物的遺傳信息顯現(xiàn)出來(lái)[20]。但是PCR-DGGE技術(shù)的應(yīng)用存在一定的局限性，因其具有很大的隨機(jī)性，檢測(cè)過(guò)程中菌種數(shù)量的改變和DNA含量的變化都會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的偏差。

2 RT-FQPCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒矗≧T-FQPCR）技術(shù)是通過(guò)監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程中所加入熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)，利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)未知樣品進(jìn)行定量分析的一種核酸定量技術(shù)[21]。與傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法相比，PCR更簡(jiǎn)便、更靈敏、更具有特異性，即使在沒(méi)有選擇性增菌培養(yǎng)基和存在其他種群的情況下，也能檢測(cè)到亞優(yōu)勢(shì)種群。RT-FQPCR的出現(xiàn)，一舉克服了常規(guī)PCR技術(shù)的諸多難題，簡(jiǎn)化了定量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，熒光定量可以實(shí)現(xiàn)精確定量，普通PCR則不行，RT-FQPCR可以看到整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程，包括擴(kuò)增效率、溶解溫度、標(biāo)準(zhǔn)曲線等，這些是普通PCR技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，RT-FQPCR技術(shù)在基本實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量的同時(shí)，顯著提高了工作效率。RT-FQPCR包括一系列的擴(kuò)增循環(huán)，在這些循環(huán)中，模板核酸被變性，用特定的寡核苷酸引物退火，并使用耐熱的DNA聚合酶延伸以產(chǎn)生互補(bǔ)鏈。這導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物呈指數(shù)增長(zhǎng)，與終點(diǎn)PCR相比，可以使用熒光報(bào)告程序在每個(gè)周期實(shí)時(shí)進(jìn)行監(jiān)測(cè)[22]。隨著生物芯片技術(shù)和熒光探針定量技術(shù)的結(jié)合，RT-FQPCR在微生物研究及其他領(lǐng)域中也會(huì)擁有更加廣闊的應(yīng)用前景[23]。

目前RT-FQPCR檢測(cè)方法如圖2所示，主要有三種：①雙鏈DNA內(nèi)插染料；②分子信標(biāo)技術(shù)；③TaqMan探針[24]。雙鏈DNA內(nèi)插染料是熒光實(shí)時(shí)定量PCR中常用的方法之一。有些染料可以選擇性的與雙鏈DNA結(jié)合，同時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，如SYBR Green Ⅰ，在水溶液中，染料本身的熒光強(qiáng)度很低，一旦插入雙鏈DNA中，染料就會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，當(dāng)染料從DNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)熒光強(qiáng)度急劇降低[25]。因此在PCR體系中，熒光的信號(hào)強(qiáng)度與DNA的含量成正比。對(duì)于熒光定量檢測(cè)，雙鏈DNA內(nèi)插染料是一種成本低廉的選擇。分子信標(biāo)技術(shù)是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence reso nance energy transfer，F(xiàn)RET）設(shè)計(jì)的一種熒光標(biāo)記核酸探針，在同一探針的兩末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，該探針5'端和3'端可形成一個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，攜帶約8個(gè)互補(bǔ)堿基。當(dāng)溶液中無(wú)特異性模板時(shí)，探針末端兩基團(tuán)鄰近，無(wú)信號(hào)產(chǎn)生。反之，特異性模板與探針結(jié)合，上面的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，即FRET被破環(huán)。特異性模板濃度越高，溶液產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度也越高，因此可用于PCR定量分析[26]。

圖2 RT-FQPCR三種信號(hào)監(jiān)測(cè)方式的原理圖[24]Fig.2 Schematic diagram of three signal monitoring methods of RT-FQPCR

目前，RT-FQPCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的定量分析。羅青春等[27]采用RT-FQPCR技術(shù)對(duì)不同年份窖泥中主要產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行了定量研究，王興興等[28]基于RT-FQPCR方法初步分析了西藏開(kāi)菲爾粒中細(xì)菌與酵母菌的數(shù)量變化。同時(shí)，陶京蘭等[29]利用RT-FQPCR監(jiān)測(cè)鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中微生物變化，證實(shí)了醋醅中的微生物主要為醋酸菌、乳酸菌和酵母菌，三者在細(xì)菌和真菌總和占比中超過(guò)80%。并對(duì)醋酸發(fā)酵階段醋醅中總細(xì)菌、總真菌、醋酸菌、乳酸菌和酵母菌的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了定量分析。對(duì)于食醋發(fā)酵過(guò)程的控制以及提高產(chǎn)品的風(fēng)味具有重要的生產(chǎn)意義。

雖然RT-FQPCR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)盡顯無(wú)疑，但也有一定的局限性，如實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高，實(shí)驗(yàn)材料成本高，不能實(shí)時(shí)檢測(cè)出豐度較小的PCR產(chǎn)物數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理繁瑣等[30]。隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，尤其是與基因芯片、高通量測(cè)序等其他生物技術(shù)的結(jié)合，RT-FQPCR技術(shù)正在經(jīng)歷快速的改進(jìn)和完善。

3 宏基因組測(cè)序技術(shù)

自2005 年以來(lái)，隨著分子技術(shù)的發(fā)展，以羅氏公司454測(cè)序技術(shù)、Illumina公司的Solexa測(cè)序技術(shù)和ABI公司的Solid 測(cè)序技術(shù)為代表的高通量測(cè)序技術(shù)相繼誕生，并迅速?gòu)V泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物群落的宏基因組研究中[31-32]。與傳統(tǒng)的16S rDNA技術(shù)相比，宏基因組測(cè)序?qū)⒀芯可钊胫粱蚝凸δ軐用?，能?duì)微生物群落結(jié)構(gòu)、基因功能活性、微生物之間的相互作用關(guān)系以及微生物與環(huán)境之間的關(guān)系進(jìn)行全面剖析，為微生物群落的研究及微生物資源的利用提供了有效工具[33-34]。

宏基因組測(cè)序技術(shù)步驟如圖3所示，主要包括：①樣品準(zhǔn)備；②DNA提??；③宏基因測(cè)序。宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)抽提的DNA量和完整性要求很高，盡可能保證獲得的環(huán)境微生物組DNA的質(zhì)量和完整度，建立宏基因組文庫(kù)，對(duì)宏基因組文庫(kù)中的DNA片段進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后通過(guò)Illumina Hiseq PE150、Roche 454焦磷酸等測(cè)序平臺(tái)對(duì)DNA片段進(jìn)行測(cè)序[35]。

圖3 宏基因組測(cè)序技術(shù)分析微生物菌群Fig.3 Analysis of microbial community by metagenomic sequencing technology

近年來(lái)，宏基因組測(cè)序逐漸應(yīng)用于食品微生物的研究，并取得了一系列研究成果。JUNG J Y等[36]利用宏基因組的方法來(lái)監(jiān)測(cè)泡菜發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌種群、代謝潛能和微生物群落整體遺傳特征的變化，其中源自宏基因組16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，泡菜的微生物群落主要由明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳酸菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）3個(gè)屬組成。同時(shí)從宏基因組數(shù)據(jù)中還發(fā)現(xiàn)了大量噬菌體DNA序列，這些結(jié)果不僅深入揭示泡菜發(fā)酵微生物的功能，也揭示了復(fù)雜的微生物群落對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響。此外，研究人員通過(guò)宏基因組測(cè)序并與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行相關(guān)的注釋，分別研究可可豆[37]、普洱茶[38]、奶酪[39]和傳統(tǒng)發(fā)酵飲料[40]等發(fā)酵食品。湯涵嵐[41]則將其推廣應(yīng)用到食醋大曲發(fā)酵中功能微生物和酶系的研究，通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室模擬食醋大曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程，以增溫實(shí)驗(yàn)組（HT）和對(duì)照組（MT）兩批次大曲為研究對(duì)象，結(jié)合宏基因組技術(shù)分析增溫對(duì)食醋大曲發(fā)酵過(guò)程微生物菌群的影響，揭示了增溫對(duì)食醋大曲發(fā)酵過(guò)程中的微生物菌群的影響，為大曲微生物及酶系形成機(jī)理提供參考依據(jù)，對(duì)傳統(tǒng)釀造工藝改進(jìn)和提升食醋品質(zhì)具有重要意義。

宏基因測(cè)序技術(shù)為環(huán)境微生物群落的研究提供了有效工具，其研究的對(duì)象是特定環(huán)境中的總DNA，不是某特定的微生物或其細(xì)胞中的總DNA，不需要對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)和純化，此技術(shù)特點(diǎn)打破了傳統(tǒng)微生物學(xué)基于純培養(yǎng)研究的限制，這對(duì)認(rèn)識(shí)和利用95%以上的未培養(yǎng)微生物提供了一條新的途徑。

4 宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)

宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是當(dāng)今基因組學(xué)研究中最為重要的方法之一，其研究對(duì)象是自然界相對(duì)復(fù)雜的微生物群體，宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以分析活躍的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，更關(guān)注于微生物群落的動(dòng)態(tài)變化，填補(bǔ)了測(cè)序技術(shù)的空白[42]。它以微生物群落的總RNA為研究對(duì)象，提取樣品總RNA，將信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA），進(jìn)而對(duì)cDNA分析來(lái)反映特定時(shí)空下基因的表達(dá)情況[43]。早期轉(zhuǎn)錄組研究主要運(yùn)用微陣列芯片技術(shù)，但是設(shè)計(jì)和構(gòu)建微陣列芯片費(fèi)用高而且費(fèi)時(shí)，且不能檢測(cè)到設(shè)計(jì)模板之外的基因的表達(dá)水平。而宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)較好地解決了這一困境，它針對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，可全面快速地獲取特定樣品在某一特定狀態(tài)下的完整表達(dá)信息，普遍應(yīng)用于差異表達(dá)基因分析、功能基因挖掘、轉(zhuǎn)錄圖譜繪制等各個(gè)方面。與宏基因組技術(shù)相比，該技術(shù)解決了前者無(wú)法準(zhǔn)確揭示特定時(shí)空條件下微生物群落基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)與調(diào)控的缺點(diǎn)。

宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析食品微生物群落的主要操作流程如圖4所示，主要包括：①樣品檢測(cè)；②文庫(kù)構(gòu)建；③文庫(kù)質(zhì)控；④上機(jī)測(cè)序。高質(zhì)量的RNA 是整個(gè)項(xiàng)目成功的基礎(chǔ)，為保證測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，需要先對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)樣品純度要求RNA的OD值應(yīng)在1.8～2.2之間，樣品質(zhì)量濃度不低于400 ng/μL，樣品總量不低于15 μg。文庫(kù)構(gòu)建完成后，對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到要求后方可進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，不同文庫(kù)按照目標(biāo)數(shù)據(jù)量利用Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

圖4 宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析微生物菌群Fig.4 Analysis of microbial community by macro-transcriptome sequencing technology

測(cè)序技術(shù)飛速發(fā)展，通過(guò)對(duì)食品中的微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，能夠明確發(fā)酵機(jī)理和菌種的代謝過(guò)程，從而對(duì)菌種進(jìn)行篩選和優(yōu)化提供重要的指導(dǎo)。近年來(lái)，宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在食品行業(yè)漸漸崛起，食品科學(xué)界已廣泛應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)各種發(fā)酵食品（如豆醬[44]，泡菜[45]，酸馬奶[46]等）發(fā)酵過(guò)程中微生物的多樣性。ING M等[47-48]分別對(duì)茅臺(tái)酒酒醅和食醋醋醅中微生物間的相互作用進(jìn)行探究，為功能微生物研究奠定了基礎(chǔ)。牟俊[49]則利用高通量測(cè)序方法重點(diǎn)分析了山西老陳醋醋酸發(fā)酵階段乳酸菌和醋酸菌的組成和演替規(guī)律，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法對(duì)其相互作用機(jī)制進(jìn)行初步解析，對(duì)深入理解山西老陳醋釀造機(jī)理具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序包括真核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和原核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，該技術(shù)通過(guò)快速獲得某一物種特定的細(xì)胞或組織，在某一狀態(tài)下的大部分的轉(zhuǎn)錄本及基因序列，對(duì)研究對(duì)象的基因結(jié)構(gòu)和基因功能、可變剪接和新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)等進(jìn)行系統(tǒng)的研究[50]。該技術(shù)的應(yīng)用也會(huì)受到一些因素的影響，如RNA的降解和RNA的起始量不足都會(huì)影響測(cè)序的質(zhì)量[51]，但隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的相關(guān)研究也會(huì)越來(lái)越深入。

5 近年來(lái)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的研究方法匯總

對(duì)近年來(lái)傳統(tǒng)發(fā)酵食品菌群研究情況進(jìn)行了匯總，如表1所示。基于新技術(shù)強(qiáng)大的破譯復(fù)雜微生物群落的能力，以上技術(shù)已逐漸被人們應(yīng)用于闡明不同種類傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物群落的組成和動(dòng)態(tài)，取得了一系列重要的研究成果。

表1 近年傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的研究方法匯總Table 1 Summary of research methods for microorganisms in traditional fermented foods in recent years

6 傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的研究方法的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比

對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的研究方法（PCR-DGGE、RT-FQPCR、宏基因組測(cè)序、宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序）優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了歸納和對(duì)比，如表2所示，PCR-DGGE和RT-FQPCR的優(yōu)勢(shì)在于菌群種類的鑒定，而宏基因組測(cè)序和宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序則深入至具體的生物學(xué)功能，因此獲得的生物學(xué)信息更加的深入和全面[43]。隨著檢測(cè)成本的日益降低，宏基因組相關(guān)的技術(shù)將成為未來(lái)研究的主流技術(shù)。

表2 傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的四種分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比Table 2 Comparison of advantages and disadvantages of four research methods for microorganisms in traditional fermented foods in recent years

7 展望

傳統(tǒng)發(fā)酵食品種類繁多，但是大部分仍沿用傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝，其質(zhì)量的穩(wěn)定性與多種微生物密切相關(guān)，菌群的研究可以為發(fā)酵機(jī)理和代謝過(guò)程做出重要解析。但不同菌群和同一菌群之內(nèi)基因組序列均有不同程度變化，從百分之幾到千分之幾不等，必須測(cè)定成千上萬(wàn)個(gè)體的基因組序列才能為傳統(tǒng)發(fā)酵食品提供更加全面的依據(jù)，因此需要對(duì)測(cè)序的通量提高要求。隨著生物過(guò)程的研究，高通量測(cè)序技術(shù)將逐漸與生物數(shù)據(jù)庫(kù)、深度學(xué)習(xí)等智能化信息技術(shù)相結(jié)合，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵機(jī)制的全方位解析，推動(dòng)傳統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程的現(xiàn)代化與智能化升級(jí)，同時(shí)不同代次的測(cè)序技術(shù)依然會(huì)長(zhǎng)期共存和發(fā)展，力求通過(guò)各自的性能優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)不足。