王雪梅 龍葉峰 周樂松 伍泳達(dá) 范 瑞 周春暉*

（1廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510030；2廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東廣州 510303）

羊肚菌（Morchella esculenta）又稱羊蘑、羊肚菜、羊肚蘑，其多糖是羊肚菌體內(nèi)主要的活性成分，具有抗病毒、抗腫瘤、抗疲勞、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、降血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣化等眾多功效。目前，羊肚菌仍以烹飪食用為主，其他加工食品較少，因此，提取羊肚菌的功能活性成分——多糖，并研制出無須烹調(diào)、方便攜帶、食用便利的羊肚菌多糖飲液，有利于提高羊肚菌多糖的利用價(jià)值。羊肚菌多糖提取方法主要有水提法、酶解法、超聲波輔助提取法、微波萃取法等。筆者以云南麗江的羊肚菌為原料，采用酶解水提法提取羊肚菌多糖，并采用正交法研制成羊肚菌多糖飲液，為羊肚菌多糖功能食品的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與主要設(shè)備

泛美羊肚菌（中號(hào)）：購自云南麗江批發(fā)市場(chǎng)；纖維素酶（酶活性為1×105U/g），和氏璧生物科技有限公司；菠蘿蛋白酶（酶活性為1×105U/g），鑫誠生物科技有限公司；無水乙醇，河南鑫河陽酒精有限公司；葡萄糖：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；98%濃硫酸，洛陽市化學(xué)試劑有限公司；苯酚，天津市永大化學(xué)試劑有限公司。試驗(yàn)中所用化學(xué)試劑均為分析純。

101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；FW177型中草藥粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；pH-100筆式酸度計(jì)，上海力辰邦西儀器科技有限公司；LH-Q90型折光儀，杭州陸恒生物科技有限公司；JJ500A型分析天平，福建艾杰爾進(jìn)出口有限公司；V-5100型分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取多糖

1.2.1.1 提取流程

取大小相近的羊肚菌子實(shí)體剪柄除雜，放置干燥箱中55℃干燥3 h，粉碎，過孔徑0.425 mm網(wǎng)，得到羊肚菌粉末，置干燥器中保存?zhèn)溆肹1]。取5 g羊肚菌粉末，加入150 mL去離子水溶解，加入1%的纖維素酶，調(diào)節(jié)pH為5.0，55℃酶解1 h，然后升溫至80℃水提2 h，升溫至95℃滅活，離心取上清液，加入4倍無水乙醇醇沉18 h，5 000 r/min離心15 min，取沉淀用相同倍數(shù)去離子水溶解，加入1%菠蘿蛋白酶50℃酶解1 h脫蛋白，離心取上清液，即得羊肚菌多糖溶液。

1.2.1.2 多糖含量的檢測(cè)

采用硫酸-苯酚法對(duì)多糖進(jìn)行檢測(cè)。將羊肚菌多糖溶液定容至50 mL容量瓶，移取2.0 mL至試管中，加入1.0 mL 6%的苯酚溶液、5.0 mL的濃硫酸，搖勻、靜置30 min，490 nm處測(cè)定吸光值[2]。

其中，C為羊肚菌多糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）；N為試驗(yàn)中的稀釋倍數(shù)；M為羊肚菌子實(shí)體的質(zhì)量（g）；V為多糖溶液稀釋的倍數(shù)；f為換算系數(shù)。

1.2.1.3 多糖提取單因素試驗(yàn)

以多糖得率為指標(biāo)，分別選取液料比、酶解酶用量、酶解時(shí)間、浸提時(shí)間為影響因素，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)多糖得率的影響（控制其他因素不變），單因素試驗(yàn)因素設(shè)置：液（mL）料（g）比20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1；酶用量0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%；酶解時(shí)間0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h；浸提時(shí)間1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h。

1.2.1.4 響應(yīng)面優(yōu)化多糖提取工藝

為了有效優(yōu)化羊肚菌多糖的提取工藝，依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取液料比、酶解時(shí)間、浸提時(shí)間三個(gè)影響顯著的因素，以多糖得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.5設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面因素和水平見表1。

1.2.2 羊肚菌多糖飲液制備

取適量的羊肚菌多糖溶液，加入適量的三氯蔗糖、低聚果糖、VC，攪拌均勻，轉(zhuǎn)移至均質(zhì)機(jī)均質(zhì)15 min，裝瓶50 mL，90℃滅菌20 min，冷卻后即可得到成品。

1.2.2.1 飲液評(píng)價(jià)指標(biāo)

如表2所示，飲液以感官評(píng)價(jià)為綜合指標(biāo)，其中風(fēng)味30分、口感30分、組織狀態(tài)25分、色澤15分，滿分100分。

表2 羊肚菌多糖飲液感官評(píng)價(jià)內(nèi)容

1.2.2.2 羊肚菌多糖飲液單因素試驗(yàn)

選定三氯蔗糖添加量為0.15 g/kg、低聚果糖添加量為40 g/kg、VC添加量為0.4 g/kg，多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL，分別考察不同多糖質(zhì)量濃度（1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL、2.5 mg/mL、3 mg/mL）、三氯蔗糖添加量（0.05 g/kg、0.1 g/kg、0.15 g/kg、0.2 g/kg、0.25 g/kg）、低聚果糖添加量（20 g/kg、30 g/kg、40 g/kg、50 g/kg、60 g/kg）、VC添 加 量（0.25 g/kg、0.3 g/kg、0.35 g/kg、0.4 g/kg、0.45 g/kg）對(duì)羊肚菌多糖飲液的影響。

1.2.2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化多糖飲液配方

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選定多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL，選取三氯蔗糖添加量、低聚果糖添加量、VC添加量進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平如表3。

表3 多糖飲液正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌多糖提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可得，羊肚菌多糖得率均隨液料比、酶用量、酶解時(shí)間、浸提時(shí)間的增大（延長）呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。分別在液料比35∶1、酶用量1.20%、酶解時(shí)間1.5 h、浸提時(shí)間2 h時(shí)，多糖得率達(dá)最大值，分別為6.46%、5.71%、6.02%、6.32%，隨后開始下降。原因可能是液料比過大，過量提取劑對(duì)提取體系內(nèi)的傳熱和傳質(zhì)造成影響而導(dǎo)致多糖得率下降[3]；酶用量過多，過多的酶使已經(jīng)飽和的酶分子與反應(yīng)底物接觸過度而降低體系的反應(yīng)速度，使多糖溶出量減少[4]；酶解時(shí)間過長，導(dǎo)致少量羊肚菌多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[5]，使多糖得率逐漸下降；浸提時(shí)間過度延長，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓趨于平衡，多糖溶出水溶液的推動(dòng)力逐步下降，同時(shí)長時(shí)間的高溫會(huì)使一部分多糖發(fā)生降解[6]，導(dǎo)致羊肚菌多糖得率下降。

圖1 不同液料比、酶用量、酶解時(shí)間、浸提時(shí)間對(duì)羊肚菌多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，固定酶用量為1.2%，以液（mL）料（g）比（A）、酶解時(shí)間（B）、浸提時(shí)間（C）為顯著因素，響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果如表4。

表4 提取多糖響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

對(duì)表4試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，所得回歸方程為Y=7.23+0.011A+0.080B+0.069C+1.000E-002AB+0.073AC-0.10BC-0.25A2-0.29B2-0.26C2，回歸模型方差如表5所示。

表5 回歸模型方差表

由表5可得，各因素對(duì)多糖得率影響的程度依次為B（酶解時(shí)間）＞C（浸提時(shí)間）＞A（液料比），回歸模型的F為9.29，P＜0.01，極顯著，失擬項(xiàng)的F為16.60，P＜0.05，失擬項(xiàng)不顯著，該模型擬合度較好，且科學(xué)、可用。

由圖2的響應(yīng)面圖和等高線圖可得，各因素中每兩兩因素之間交互作用顯著，在液料比32∶1~38∶1、酶解時(shí)間1.2~1.8 h時(shí)；液料比32∶1~38∶1、浸提時(shí)間1.7~2.3 h時(shí)；酶解時(shí)間1.2~1.8 h、浸提時(shí)間1.7~2.3 h時(shí)，多糖得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。經(jīng)過對(duì)模型的分析，得到最佳配方：液料比35.21∶1，酶解時(shí)間1.56 h，浸提時(shí)間2.06 h，該條件多糖得率為7.24%，為方便操作，將提取工藝修改為液料比35∶1，酶解時(shí)間1.5 h，浸提時(shí)間2 h，經(jīng)驗(yàn)證羊肚菌多糖得率為7.21%，優(yōu)化效果明顯。

2.3 羊肚菌飲液單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖3可得，羊肚菌多糖飲液的得分均隨多糖質(zhì)量濃度、三氯蔗糖添加量、低聚果糖添加量、VC添加量的上升呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL、三氯蔗糖添加量為0.15 g/kg、低聚果糖添加量為40 g/kg、VC添加量為0.4 g/kg時(shí)，羊肚菌飲液的得分均達(dá)最高，隨后開始下降。其原因是羊肚菌多糖本身具有獨(dú)特的風(fēng)味，其添加量過多或過少均會(huì)影響飲液口感，三氯蔗糖、低聚果糖有甜味，VC有酸味，甜味過多或者酸味過多均會(huì)影響飲液的口感。

圖2 響應(yīng)面圖和等高線圖

圖3 羊肚菌多糖質(zhì)量濃度，三氯蔗糖、低聚果糖、VC添加量對(duì)飲液綜合得分的影響

2.4 羊肚菌多糖飲液正交試驗(yàn)結(jié)果

由表6可知，三個(gè)因素對(duì)羊肚菌多糖飲液結(jié)果影響的程度為A＞C＞B，即三氯蔗糖的添加量＞VC的添加量＞低聚果糖的添加量，三氯蔗糖添加量對(duì)飲液配方的影響最大，低聚果糖添加量對(duì)飲液配方的影響最小，最優(yōu)組合為A2B2C2，即三氯蔗糖的添加量為0.15 g/kg，低聚果糖的添加量為40 g/kg，VC的添加量為0.4 g/kg。

表6 羊肚菌多糖飲液正交試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

酶解水提法提取羊肚菌多糖，并利用其研制羊肚菌多糖飲液。設(shè)置單因素試驗(yàn)，通過方差分析排除對(duì)多糖得率影響較小的因素，并對(duì)其他影響因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，最終得到提取羊肚菌多糖最佳工藝。選定羊肚菌多糖濃度為2 mg/mL，對(duì)其他因素正交試驗(yàn)研制多糖飲液，直觀分析得到羊肚菌飲液最佳的配方為多糖2 mg/mL，三氯蔗糖0.15 g/kg，低聚果糖40 g/kg、VC 0.4 g/kg。低聚果糖不易引起齲齒，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、緩解便秘、降血脂等功效，目標(biāo)人群廣泛。

羊肚菌是世界公認(rèn)的珍稀食用菌之一，提取羊肚菌多糖并加工成功能食品，豐富羊肚菌高附加值產(chǎn)品。試驗(yàn)也為羊肚菌功能食品的研制提供了參考。