黃 靖，楊 磊，林大河，林素英，林海燕，包君麗*

(1. 莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院 福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 莆田 351100； 2. 青海大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810016)

肺纖維化(Pulmonary fibrosis, PF)是以成纖維細(xì)胞增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)聚集并伴炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的一大類肺疾病終末期改變[1]。肺纖維化的病因主要分為兩類，一類為已知原因，主要為職業(yè)與環(huán)境吸入疾病，包括吸入無機(jī)粉塵、有機(jī)粉塵和各種刺激性有毒氣體；另一類為未知原因，這組疾病稱為特發(fā)性間質(zhì)性肺炎，是間質(zhì)性肺病中一大類[2]。肺纖維化嚴(yán)重影響人體呼吸功能，表現(xiàn)為干咳、進(jìn)行性呼吸困難，且隨著病情和肺部損傷加重，患者呼吸功能不斷惡化[3]。肺纖維化發(fā)病率和死亡率逐年增加，診斷后的平均生存期僅2.8年，死亡率高于大多數(shù)腫瘤，被稱為一“類腫瘤疾病”[4]。鑒于肺纖維化發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前臨床上尚無針對性西醫(yī)藥物[5]。

中醫(yī)近年在治療肺纖維化方面形成了自己的一些特點(diǎn)，也取得了一定的的成果[6]。中醫(yī)古代文獻(xiàn)中雖無與肺纖維化相對應(yīng)的病名記載，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸為“肺痿”和“肺痹”范疇[7]。枇杷葉是治療呼吸道炎癥性疾病的常見中藥材之一，具有悠久的歷史。近些年來，枇杷葉在改善肺纖維化癥狀上療效顯著[8]。然而，目前枇杷葉對肺纖維化的相關(guān)作用機(jī)制尚未明確，使得臨床作用的發(fā)揮具有很大局限性。

中藥化學(xué)成分多、方劑中多種中藥相互作用、實(shí)驗(yàn)周期長、工作量大，而且不能全面地進(jìn)行靶標(biāo)測試，無法系統(tǒng)地從化合物成分-靶點(diǎn)去驗(yàn)證。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)，通過大數(shù)據(jù)挖掘的方法，對藥物進(jìn)行多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的網(wǎng)絡(luò)作用關(guān)系分析，從科學(xué)、全面的角度分析藥物治療疾病的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥的研究及應(yīng)用提供方向[9]。分子對接是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)的方法，主要研究分子間(如配體和受體)相互作用，并預(yù)測其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法[10]。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選枇杷葉有效活性成分，預(yù)測治療肺纖維化相關(guān)靶標(biāo)和通路，構(gòu)建“疾病-藥物-成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖，全面分析探討枇杷葉治療肺纖維化的可能作用機(jī)制，再利用分子對接技術(shù)對枇杷葉中活性成分與肺纖維化關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白進(jìn)行模擬結(jié)合研究。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分的收集

為收集枇杷葉的化合物成分，利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/TCMSP.php)[11]，以“枇杷葉”為關(guān)鍵詞在“Herb name”條目中檢索其化學(xué)成分，根據(jù)藥物化合物分子的ADME參數(shù)分析，結(jié)合到后期用藥量化分析，設(shè)定口服生物利用度(Oral bio- availability，OB)≥30%，成藥相似性(Drug Like，DL)≥0.18，篩選獲得初步滿足網(wǎng)絡(luò)藥理數(shù)據(jù)分析標(biāo)準(zhǔn)的化合物分子。

1.2 活性成分候選靶標(biāo)對應(yīng)基因的收集

為了收集枇杷葉主要化合物的相應(yīng)靶點(diǎn)，采用了以下方法。首先，查詢由TCMSP數(shù)據(jù)庫所提供的潛在作用靶點(diǎn)蛋白全稱，然后借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)[12]對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因名稱的注釋；同時將枇杷葉的潛在化合物分子按照名稱通過Stitch數(shù)據(jù)庫(http://Stitch.embl.de/，ver)[13]查詢與其對應(yīng)的靶點(diǎn)基因；下載由TCMSP查詢得到的化合物分子MOL2的格式文件，依次輸入到Swiss target prediction 數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)[14]查詢相應(yīng)靶點(diǎn)，最后將以上數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果整理合并，盡最大可能確保數(shù)據(jù)的完整性。

1.3 肺纖維化相關(guān)靶標(biāo)基因的收集

檢索人類基因組注釋(Genecards)數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)[15]和《人類孟德爾遺傳》(OMIN)數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)[16]，以“pulmonary fibrosis”為關(guān)鍵詞，將得到的疾病相關(guān)基因進(jìn)行整理，作為肺纖維化疾病相關(guān)基因。

1.4 活性成分-作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

剔除掉重復(fù)及與疾病沒有相關(guān)性的靶點(diǎn)，再將剩余的藥物活性成分與肺纖維化治療作用靶標(biāo)及相關(guān)通路構(gòu)建相應(yīng)的數(shù)據(jù)表，以構(gòu)建的關(guān)系數(shù)據(jù)表作為Cytoscape 3.7.2的輸入文件構(gòu)建化合物成分及潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，展示藥物活性成分與作用肺纖維化靶標(biāo)間的作用關(guān)系。

1.5 靶蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將枇杷葉治療肺纖維化的潛在作用靶標(biāo)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)[17]，限制物種為“Homo sapiens”，獲取蛋白互作關(guān)系，以“TSV”格式導(dǎo)出結(jié)果。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape3.7.2 軟件進(jìn)行可視化處理，通過Network analyzer工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析從而獲得 Degree值，繪制蛋白互作(Protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，并以PNG格式導(dǎo)出。

1.6 基因本體富集(Gene ontology，GO)及特定物種種屬代謝通路 (Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析

將枇杷葉治療肺纖維化潛在作用靶標(biāo)基因利用R語言的Clusterprofile程序包進(jìn)行GO基因富集分析和KEGG通路富集分析，設(shè)定P_Value≤0.05得到相應(yīng)的生物學(xué)過程及KEGG通路相關(guān)數(shù)據(jù)，然后將所得KEGG數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2進(jìn)行可視化圖形繪制。

1.7 分子對接

從PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www.pdb.org/)下載枇杷葉重要化合物結(jié)合的候選蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)，并用MOE軟件進(jìn)行修飾，以去除配體、添加氫、去除水、優(yōu)化和修補(bǔ)氨基酸，并使所有候選靶點(diǎn)的能量最小化。我們使用MOE來測試枇杷葉化合物與候選靶蛋白之間的對接精度，因?yàn)樗哂休^高的準(zhǔn)確性和一致性。整體評估的最終得分是E_score = 2，對應(yīng)的數(shù)值越小，分子之間的結(jié)合能越小，這意味著兩者之間有較好的結(jié)合性(一般小于-5)。同時，用不同的顏色標(biāo)記小分子的結(jié)構(gòu)，我們可以觀察到兩者之間的結(jié)構(gòu)空間有較大的重復(fù)區(qū)域，這證明了小分子構(gòu)象與配體之間有很大的相似性。

2 結(jié) 果

2.1 枇杷葉選活性成分及候選靶標(biāo)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到枇杷葉活性成分共304個，再根據(jù)藥物動力學(xué)特點(diǎn)設(shè)定閾值OB≥30%，DL≥0.18后，篩選出枇杷葉候選成分18個(見表1)，同時在平臺檢索這些候選活性成分的靶標(biāo)，共134個。由Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫獲取的靶標(biāo)共有560個，篩選Probability大于0后共351個。將兩個數(shù)據(jù)庫搜索得到的靶標(biāo)匯總?cè)ブ睾蠊灿邪袠?biāo)464個。

表1 枇杷葉候選活性成分

續(xù)表1 枇杷葉候選活性成分

2.2 藥物活性成分治療肺纖維化候選靶標(biāo)預(yù)測

人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫中肺纖維化相關(guān)基因786個，OMIM數(shù)據(jù)庫所得肺纖維化相關(guān)基因218個，去重后共得肺纖維化相關(guān)基因960個。再將藥物候選基因與肺纖維化相關(guān)基因取交集，獲得可能與肺纖維化有關(guān)作用靶標(biāo)103個。篩選過程見圖1。

2.3 藥物-化合物-疾病-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將枇杷葉活性成分和與肺纖維化的作用靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建藥物-化合物-疾病-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。所構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)共包括152個節(jié)點(diǎn)，其中18個活性成分節(jié)點(diǎn)，103個作用靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)，2286條邊線。通過圖2可以看出枇杷葉主要通過多成分對應(yīng)多靶標(biāo)來發(fā)揮對肺纖維化治療作用。

2.4 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

將枇杷葉治療肺纖維化潛在作用靶標(biāo)基因?qū)隨tring蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫獲取靶標(biāo)蛋白互作關(guān)系圖，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，菜單欄選擇tools，然后運(yùn)用analysis network，配置節(jié)點(diǎn)大小和顏色以跟隨degree進(jìn)行連續(xù)性變化，再配置邊的顏色和粗細(xì)跟隨combine_score進(jìn)行連續(xù)性變化，最后根據(jù)節(jié)點(diǎn)度數(shù)將靶基因布局為四個同心圓，最外圍的節(jié)點(diǎn)度數(shù)小于20，第三層的靶基因節(jié)點(diǎn)度數(shù)介于20-39，第二層的靶基因節(jié)點(diǎn)度數(shù)介于40-59，最里層的節(jié)點(diǎn)度數(shù)大于等于60。此網(wǎng)絡(luò)圖共包括103個節(jié)點(diǎn)，1463條邊，圖中 Degree 越大則節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，根據(jù)靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖計(jì)算得出相關(guān)節(jié)點(diǎn)度數(shù)的平均值為31，選取節(jié)點(diǎn)度數(shù)大于31的靶點(diǎn)(共計(jì)42個)作為重點(diǎn)研究，如AKT1、VEGFA、IL6、EGFR、CASP3等，可認(rèn)為這些個靶標(biāo)與枇杷葉治療肺纖維化相關(guān)性較大，見圖3。

圖1 枇杷葉作用肺纖維化靶點(diǎn)篩選Fig. 1 The target genes of pulmonary fibrosis on the treatment by E. japonica

圖2 藥物-化合物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 2 Compounds-disease targets-mechanism network

圖3 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig. 3 Drug Target Protein-Protein Interaction Networks

2.5 枇杷葉中活性成分對應(yīng)潛在靶標(biāo)基因生物功能及通路分析

GO富集分析結(jié)果顯示：① 生物過程(Biological process，BP)分析富集基因數(shù)量較大的有活性氧代謝過程、活性氧代謝過程的正調(diào)控、活性氧代謝過程的調(diào)控、MAP激酶活性的調(diào)節(jié)對氧氣水平的反應(yīng)等(圖4)，②細(xì)胞分組(Cellular component，CC)分析中富集基因數(shù)量較大的有膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等(圖 5)，③分子功能(Molecular function，MF)分析富集基因數(shù)量較大的有蛋白酪氨酸激酶活性胰島素受體底物結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性絲氨酸型內(nèi)肽酶活性等(圖6)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，共138條通絡(luò)(P_Value<0.05)，如AGE-RAGE信號通路、膀胱癌、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)等(圖7)。

2.6 分子對接

為了驗(yàn)證肺纖維化中枇杷葉靶點(diǎn)的候選化合物，測試了23-trans-p-coumaryhormentic acid和以下潛在靶蛋白: EGFR(PDB：2JIV)、MMP2(PDB：4KWE)和MMP9(PDB：6ESM)之間的對接精度(圖8)。對接分析結(jié)果表明，靶蛋白和對應(yīng)的化合物分子的得分小于-5，表明靶蛋白和化合物分子之間有較好的結(jié)合性(表2)。

圖4 生物過程分析Fig. 4 The BP analysis

圖5 細(xì)胞分組分析Fig. 5 The CC analysis

圖6 分子功能分析Fig. 6 The MF analysis

圖7 KEGG通路富集分析圖Fig. 7 KEGG pathway enrichment analysis diagram

圖8 23-trans-p-coumaryhormentic acid(MOL012556)與EGFR、MMP2和MMP9的分子對接Fig. 8 Molecular docking between 23-trans-p-coumaryhormentic acid(MOL012556) and (A) EGFR(B) MMP2(C)MMP9

表2 化合物-靶蛋白結(jié)合數(shù)據(jù)表

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，枇杷葉作用于肺纖維化的有效活性成分18個，潛在作用靶標(biāo)103個。根據(jù)這些靶標(biāo)進(jìn)一步收集枇杷葉治療肺纖維化的生物過程及富集通路，由此探究枇杷葉治療肺纖維化的作用機(jī)制，為其治療肺纖維化提供證據(jù)支持，更加有利于臨床的應(yīng)用，也為進(jìn)一步的試驗(yàn)研究提供思路。

枇杷葉主要含有黃酮及其苷類化合物、三萜酸類化合物、有機(jī)酸類化合物、揮發(fā)油類化合物、無機(jī)元素及其他化合物[18]。已有報道表明，枇杷葉的主要活性成分枇杷葉三萜酸治療宮頸癌療效顯著[19]。劉娟等[20]研究發(fā)現(xiàn)枇杷葉三萜酸能明顯改善肺纖維化模型大鼠肺臟組織結(jié)構(gòu)，減輕肺纖維化增生程度。楊雅茹等[21]的體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)枇杷葉三萜酸可能通過抑制ɑ-SMA基因表達(dá)來阻斷成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可能通過降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、CTGF的過度表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，也可能通過抑制ERK1/2蛋白磷酸化環(huán)節(jié)阻斷ERK通路等3個機(jī)制阻斷肺纖維化進(jìn)程，發(fā)揮其抗肺纖維化的作用。黃艷等[22]的動物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葉三萜酸能明顯改善大鼠肺臟組織結(jié)構(gòu)，減輕肺纖維化增生程度。

根據(jù)“靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖”以及文獻(xiàn)資料分析可得，復(fù)方苦參注射液治療宮頸癌可能通過作用白介素6(IL-6)、表皮生長因子受體(EGFR)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)等4個靶標(biāo)來發(fā)揮作用。王書臣等[23]采用氣管內(nèi)注入博萊霉素造成人鼠肺纖維化模型。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組IL-6的濃度始終高于正常對照組及各治療組，肺纖平能降低血清IL-6的濃度，提示IL-6是肺纖維化的治療靶點(diǎn)。蔡琳等[24]的動物試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGFR RNAi組與纖維化組比較，肺組織EGFR mRNA表達(dá)和EGFR蛋白表達(dá)均顯著下降；肺病理損傷較纖維化組減輕，肺羥脯氨酸含量顯著減少；磷酸化EGFR蛋白表達(dá)亦較纖維化組明顯減少，表明EGFR RNAi抑制了EGFR活化，減輕肺纖維化改變。任培中[25]動物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺纖維化組較對照組肺組織MMP9表達(dá)水平明顯升高，中藥初期干預(yù)組MMP9表達(dá)水平明顯降低。王勇等[26]的動物試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纖維化模型組大鼠MMP2表達(dá)水平過高，雄附方高、中、低劑量組MMP2表達(dá)水平過低，提示MMP2可能是肺纖維化的治療靶點(diǎn)。

通過文獻(xiàn)檢索及KEGG通路富集分析可知，枇杷葉治療肺纖維化主要涉及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、表皮生長因子受體(EGFR)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF-kappa B)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)等信號通路。任培中等[27]的動物試驗(yàn)結(jié)果表明通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方可通過調(diào)控mTOR/p70S6K信號通路來抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖、生長，減少透明質(zhì)酸、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，從而抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。楊偉源等[28]使用EGFR抑制劑吉非替尼對博來霉素所致小鼠肺纖維化進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示吉非替尼可通過調(diào)控EGFR/Foxo3a/Snail1信號通路從而減輕小鼠肺纖維化，提示EGFR/Foxo3a/Snail1信號通路是治療肺纖維化的關(guān)鍵通路。楊善軍等[29]的動物試驗(yàn)加味補(bǔ)陽還五湯可以調(diào)控NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來抑制肺纖維化，提示NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是治療肺纖維化的關(guān)鍵通路。欒智華等[30]的動物試驗(yàn)結(jié)果表明黃芪甲苷可通過調(diào)控VEGF/VEGFR2信號通路來改善肺纖維化。張艷霞等[31]的動物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)氣活血通絡(luò)方通過干預(yù)PI3K/AKT信號通路的活化，從而起到對抗纖維化的作用。

本研究所獲取的枇杷葉治療肺纖維化的主要活性成分為三萜酸類化合物。分子對接結(jié)果表明23-trans-p-coumaryhormentic acid與IL6、EGFR、MMP9和MMP2有較好的結(jié)合性，這些結(jié)果提供了進(jìn)一步的證據(jù)，證明這4種蛋白在肺纖維化中作為23-trans-p-coumaryhormentic acid的治療靶點(diǎn)。本研究這些靶蛋白是因?yàn)樵赑PI網(wǎng)絡(luò)圖中處于關(guān)鍵位置，同時它們參與了關(guān)鍵通路，結(jié)果提示它們在肺纖維化對化合物的反應(yīng)中可能起關(guān)鍵作用。

4 結(jié) 論

本研究表明枇杷葉治療肺纖維化的主要活性成分為黃酮及其苷類化合物、三萜酸類化合物、有機(jī)酸類化合物、揮發(fā)油類化合物、無機(jī)元素及其他化合物。這些活性成分通過作用于IL-6、EGFR、MMP-9、MMP-2等靶標(biāo)以及調(diào)節(jié)mTOR、EGFR、NF-kappa B、VEGF、PI3K-Akt等信號通路發(fā)揮對肺纖維化的治療作用從中可以看出枇杷葉治療肺纖維化具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。然而本研究未能對其他治療肺纖維化的可能機(jī)制進(jìn)行科學(xué)實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，尚存在局限性，但可以為有關(guān)試驗(yàn)研究提供思路與方向。