方敏 石艷 段莉 石小梅 全舒婷 王亞翠 彭小姍 郟繼航 綦輝 焦偉偉 朱渝 孫琳

世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)2020年全球結(jié)核病報(bào)告顯示，2019年全球兒童結(jié)核病患者約120萬(wàn)例[1]。由于結(jié)核病患兒檢測(cè)標(biāo)本采集困難、細(xì)菌載量低，難以獲得有效的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)，致早期快速診斷成為目前兒童結(jié)核病防控面臨的主要問(wèn)題。因此，亟需建立更為敏感的檢測(cè)方法和技術(shù)，以提升兒童結(jié)核病的檢出率，及早有效管理。

分子生物學(xué)方法可以直接檢測(cè)標(biāo)本中病原體核酸，具有較高的敏感度，可明顯提高結(jié)核病的診斷效率，已被《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[2]作為結(jié)核病確診的方法之一。超敏結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥基因檢測(cè)(GeneXpert MTB/RIF Ultra，簡(jiǎn)稱(chēng)“Xpert Ultra”)方法在成年人結(jié)核病診斷中表現(xiàn)出了較高的敏感度，能夠更快地為臨床提供早期診斷依據(jù)[3-6]，具有非常好的臨床應(yīng)用前景。但其目前在兒童結(jié)核病診斷中的應(yīng)用數(shù)據(jù)較少，這在一定程度上阻礙了其在臨床上的推廣。目前，用于結(jié)核病分子生物學(xué)診斷的標(biāo)本類(lèi)型多以呼吸道標(biāo)本為主，包括咳出痰、誘導(dǎo)痰、鼻咽拭子和支氣管灌洗液等[7-10]，而對(duì)其他類(lèi)型標(biāo)本的研究數(shù)據(jù)尚少。胃液是檢測(cè)兒童患者病原學(xué)的重要標(biāo)本類(lèi)型，而應(yīng)用Xpert Ultra檢測(cè)兒童結(jié)核病患者胃液的效能評(píng)價(jià)仍然較少。因此，筆者選取兒童肺結(jié)核患者和其他呼吸系統(tǒng)感染性疾病患者的胃液標(biāo)本，應(yīng)用Xpert Ultra進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)該技術(shù)對(duì)兒童肺結(jié)核的診斷效能。

對(duì)象和方法

1.研究對(duì)象：采用回顧性研究方法選取2019年7月至2020年7月就診于四川省涼山彝族自治州第一人民醫(yī)院兒科且符合入組標(biāo)準(zhǔn)的173例患兒作為研究對(duì)象，年齡范圍為0.3～14歲，中位數(shù)(四分位數(shù))為8.0(4.0，11.0)歲；男84例(48.6%)，女89例(51.4%)。僅16例(9.3%)能夠提供明確的卡介苗接種史證據(jù)，86例(49.7%)接種史不明，71例(41.0%)無(wú)接種史。研究對(duì)象中，經(jīng)臨床綜合診斷為活動(dòng)性肺結(jié)核患兒114例(觀察組)，其他呼吸系統(tǒng)感染性疾病患兒59例(對(duì)照組)。觀察組中，胃液結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)培養(yǎng)(BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)，簡(jiǎn)稱(chēng)“MGIT 960液體培養(yǎng)”)陽(yáng)性23例(20.2%)，陰性91例(79.8%)。91例培養(yǎng)陰性患兒中，有活動(dòng)性結(jié)核病臨床癥狀和體征，同時(shí)伴胸部影像學(xué)改變、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)和γ-干擾素釋放試驗(yàn)陽(yáng)性者65例(57.0%)；有活動(dòng)性結(jié)核病臨床癥狀和體征，同時(shí)伴胸部影像學(xué)改變、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)陽(yáng)性者9例(7.9%)；有活動(dòng)性結(jié)核病的臨床癥狀和體征，同時(shí)伴胸部影像學(xué)改變、γ-干擾素釋放試驗(yàn)陽(yáng)性者17例(14.9%)。對(duì)照組中，支原體感染者32例(54.3%)，細(xì)菌性感染者15例(25.4%)，未查到明確病原體但常規(guī)抗感染治療后病情好轉(zhuǎn)或治愈者12例(20.3%)。

2.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)觀察組：所有患兒均評(píng)估活動(dòng)性結(jié)核病相關(guān)臨床癥狀和體征，并進(jìn)行胃液抗酸染色、胃液MTB培養(yǎng)、胸部影像學(xué)檢查、免疫學(xué)檢查[結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)和(或)γ-干擾素釋放試驗(yàn)]，如符合以下標(biāo)準(zhǔn)則診斷為活動(dòng)性肺結(jié)核[11]：①涂片抗酸桿菌檢測(cè)陽(yáng)性或MTB培養(yǎng)陽(yáng)性；②有活動(dòng)性結(jié)核病的臨床癥狀和體征，同時(shí)伴胸部影像學(xué)改變及免疫學(xué)檢查(結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)或γ-干擾素釋放試驗(yàn))陽(yáng)性；③經(jīng)鑒別診斷排除其他肺部疾病。(2)對(duì)照組：經(jīng)評(píng)估活動(dòng)性結(jié)核病臨床癥狀和體征，并進(jìn)行胃液抗酸染色、胃液MTB培養(yǎng)、胸部影像學(xué)檢查，均不提示活動(dòng)性結(jié)核??；結(jié)合患兒存在的其他病原感染證據(jù)，以及常規(guī)抗感染治療后病情好轉(zhuǎn)或治愈的患兒。

3.排除標(biāo)準(zhǔn)：未行結(jié)核病相關(guān)檢查；未行Xpert Ultra檢測(cè)胃液；臨床資料不完全。

4.樣本采集：(1)胃液標(biāo)本：患兒入院第2日晨起空腹采集。胃管經(jīng)鼻進(jìn)入胃中，采用注射器抽取2～8 ml胃液，分裝后于-80 ℃保存。(2)痰液標(biāo)本：患兒深吸氣2～3次，每次用力呼出，咳出痰液標(biāo)本于痰盒中，于-80 ℃保存。后續(xù)分別對(duì)兩種標(biāo)本進(jìn)行MTB培養(yǎng)和Xpert Ultra檢測(cè)。

5.Xpert Ultra檢測(cè)：根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。取胃液2 ml于無(wú)菌離心管中，加入NaOH溶液進(jìn)行中和，直至NaOH終濃度為1.5%。充分振蕩10～15 s后室溫放置15 min，期間每5 min再充分振蕩混勻1次。置于離心機(jī)中4000×g離心15 min。棄上清，離心管中加入2 ml處理液，將剩余的沉淀吹打混勻后加入檢測(cè)盒中上機(jī)檢測(cè)。取痰液1 ml加入2 ml處理液，充分振蕩后室溫放置15 min，取2 ml處理后的樣本上機(jī)檢測(cè)。當(dāng)MTB DNA檢測(cè)陽(yáng)性時(shí)，依據(jù)MTB的Ct值間接反映所檢測(cè)樣本中MTB的菌載量，分為高、中、低、非常低、微量；同時(shí)對(duì)MTB菌株利福平耐藥位點(diǎn)進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果分別為利福平耐藥、敏感和不確定。

6.MGIT 960液體培養(yǎng)：取1～2 ml胃液或痰液置50 ml離心管，加入等量N-乙酰-L半胱氨酸碳酸氫鈉(NaOH-NALC)前處理液振蕩1 min后靜置15～20 min。加磷酸緩沖鹽溶液(PBS)至45 ml，置于離心機(jī)中3000×g4 ℃離心15 min。棄上清，加1 ml PBS混勻后進(jìn)行MTB培養(yǎng)。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用“百分率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以臨床綜合診斷為參照標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)Xpert Ultra 檢測(cè)胃液標(biāo)本對(duì)兒童肺結(jié)核的診斷效能，各指標(biāo)計(jì)算公式如下：敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%。各方法間的一致性檢測(cè)采用Kappa檢驗(yàn)，其中，Kappa≥0.75，說(shuō)明兩種方法診斷一致性較好；0.4≤Kappa<0.75，說(shuō)明兩種方法診斷一致性一般；Kappa<0.4，說(shuō)明兩種方法診斷一致性較差。

結(jié) 果

1.Xpert Ultra檢測(cè)胃液標(biāo)本的診斷價(jià)值：以臨床綜合診斷為參照標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Ultra診斷兒童肺結(jié)核的敏感度為53.5%(61/114)。根據(jù)患兒的年齡分為學(xué)齡前患兒(0～6歲組)和學(xué)齡期患兒(6～14歲組)，分別為57例和116例。Xpert Ultra檢測(cè)兩組患兒胃液標(biāo)本診斷肺結(jié)核的敏感度分別為66.7%(26/39)和46.7%(35/75)，前者敏感度明顯高于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.126，P=0.042)。而MTB培養(yǎng)診斷兒童肺結(jié)核的敏感度為20.2%(23/114)。具體見(jiàn)表1。

2.Xpert Ultra檢測(cè)胃液和痰液標(biāo)本診斷價(jià)值的比較：研究對(duì)象中，僅65例采集到痰液標(biāo)本，其中，觀察組采集46例，對(duì)照組采集19例。以臨床綜合診斷為參照標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Ultra檢測(cè)胃液和痰液標(biāo)本診斷兒童肺結(jié)核的敏感度分別為52.2%(24/46)和43.5%(20/46)，二者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.697，P=0.404)。具體見(jiàn)表2。

3.Xpert Ultra對(duì)胃液培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本菌載量的檢測(cè)：在胃液標(biāo)本MTB培養(yǎng)陽(yáng)性的23例患兒中，21例(91.3%)經(jīng)Xpert Ultra檢測(cè)陽(yáng)性，其菌載量分別為微量3例(14.3%)、極低載量4例(19.1%)、低載量10例(47.6%)、中等載量2例(9.5%)、高載量2例(9.5%)。在胃液MTB培養(yǎng)陰性的150例患兒中，40例經(jīng)Xpert Ultra檢測(cè)陽(yáng)性，其菌載量結(jié)果分別為微量15例(37.5%)、極低載量7例(17.5%)、低載量14例(35.0%)、中等載量1例(2.5%)、高載量3例(7.5%)。

表2 Xpert Ultra以臨床綜合診斷為參照標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)胃液和痰液標(biāo)本對(duì)兒童肺結(jié)核的診斷效能

4.Xpert Ultra對(duì)兒童肺結(jié)核的耐藥檢測(cè)：Xpert Ultra檢測(cè)胃液陽(yáng)性的61例患兒中，18例(29.5%)為微量菌載量，無(wú)法判斷其耐藥結(jié)果；5例為利福平耐藥，其中3例為MTB培養(yǎng)陽(yáng)性，但僅1例獲得 MGIT 960藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，且為異煙肼和利福平均耐藥。

討 論

2014年WHO頒布的《國(guó)家結(jié)核病規(guī)劃關(guān)于兒童結(jié)核病處理指南(第2版)》強(qiáng)烈推薦GeneXpert MTB/RIF方法可用于兒童結(jié)核病的診斷[11]。然而，該方法對(duì)MTB低菌載量標(biāo)本的檢出率仍有待提高。隨著敏感度明顯提高的新一代Xpert Ultra方法的研發(fā)，其可將檢出下限由原來(lái)的112.6 CFU/ml降為15.6 CFU/ml[12-13]，檢出時(shí)間由GeneXpert MTB/RIF所需的112 min縮短至84 min。因此，Xpert Ultra在診斷兒童等少菌結(jié)核病患者中的應(yīng)用價(jià)值更大。本研究結(jié)果顯示，Xpert Ultra檢測(cè)胃液對(duì)MTB培養(yǎng)陽(yáng)性的結(jié)核病患兒的敏感度達(dá)到了91.3%。以臨床綜合診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Ultra檢測(cè)胃液對(duì)所有結(jié)核病患兒的敏感度也達(dá)到了53.5%，說(shuō)明當(dāng)傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法難以獲得MTB感染證據(jù)時(shí)，仍有相當(dāng)比例的患兒可以通過(guò)Xpert Ultra 方法得以確診。因此，采用高敏感度的分子生物學(xué)方法可以有效提高兒童結(jié)核病的確診率。同時(shí)，該方法操作簡(jiǎn)單，采樣1～2 h即可得到檢測(cè)結(jié)果，這對(duì)于兒童結(jié)核病的早期診斷、早期治療也具有重要作用。

由于兒童本身的特點(diǎn)，尤其是嬰幼兒，往往難以取得合格的痰液標(biāo)本。本研究納入的173例患兒中，僅65例患兒可以采集到痰液標(biāo)本。同時(shí)，嬰幼兒也是結(jié)核病發(fā)病的高危人群，在其感染MTB后，很容易發(fā)展為重癥結(jié)核病。因此，尋找更適合嬰幼兒診斷的標(biāo)本類(lèi)型具有實(shí)際的臨床應(yīng)用價(jià)值。

胃液是兒童感染性疾病患者病原學(xué)檢測(cè)的重要標(biāo)本類(lèi)型，特別是5歲以下兒童的呼吸道分泌物更多的被吞咽到胃里，尤其是經(jīng)過(guò)一夜的睡眠，含MTB的分泌物在胃內(nèi)富集，更容易檢出MTB。另外，在一些咳痰困難的成年人患者中，胃液也被用于病原學(xué)的檢測(cè)[14-15]。本研究結(jié)果顯示，Xpert Ultra檢測(cè)胃液中MTB的敏感度略高于痰液，說(shuō)明Xpert Ultra對(duì)兒童肺結(jié)核具有較好的診斷價(jià)值。同時(shí)，Xpert Ultra檢測(cè)學(xué)齡前患兒胃液標(biāo)本診斷肺結(jié)核的敏感度明顯高于學(xué)齡期患兒，提示Xpert Ultra對(duì)于學(xué)齡前患兒肺結(jié)核診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值更高。一項(xiàng)德國(guó)的研究分析了2002—2010年間采用胃液標(biāo)本確診兒童肺結(jié)核的情況，結(jié)果顯示59%的肺結(jié)核患兒可通過(guò)胃液標(biāo)本檢測(cè)得以確診，且有34.7%的患兒只檢測(cè)了胃液標(biāo)本；同時(shí)，結(jié)果還顯示小于1歲患兒的檢出率最高，4歲以內(nèi)患兒的檢出率在68%左右，而10歲以上患兒的檢出率只有37%，提示檢測(cè)胃液的陽(yáng)性率隨年齡的增長(zhǎng)而逐漸下降[16]，與本研究結(jié)果一致。

胃液的采集和保存方式也對(duì)檢出率有一定影響。有研究對(duì)比分析了標(biāo)準(zhǔn)化胃液采集流程建立前后，結(jié)核病患兒胃液標(biāo)本MTB培養(yǎng)的陽(yáng)性率，盡管患者例數(shù)較少，但仍可認(rèn)為嚴(yán)格的操作者培訓(xùn)、采集時(shí)間短、吸出物標(biāo)本盡快中和并處理可有效提高病原學(xué)檢出率[17]。標(biāo)本的儲(chǔ)存時(shí)間是否會(huì)影響胃液標(biāo)本的MTB檢出率也存在不一致的結(jié)論。例如，Singh等[18]檢測(cè)冷凍儲(chǔ)存650～849 d內(nèi)胃液標(biāo)本的MTB陽(yáng)性率為77.1%，而超過(guò)1050 d后的檢測(cè)陽(yáng)性率則降至50%，說(shuō)明隨著胃液標(biāo)本儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，Xpert檢測(cè)的陽(yáng)性率也下降；但該研究也發(fā)現(xiàn)，即使檢測(cè)冷凍存放4年以上的胃液標(biāo)本，其檢出率也可以達(dá)到50%。此外，胃液采集需患兒嚴(yán)格禁食至少4 h，故最好晨起空腹取胃液，以避免食物殘?jiān)鼘?duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

隨著近年來(lái)耐藥細(xì)菌的流行，耐多藥結(jié)核病和利福平耐藥結(jié)核病的患者數(shù)居高不下。由于Xpert Ultra方法可以同時(shí)檢出利福平耐藥，因此，其在兒童耐藥結(jié)核病的早期快速診斷也具有很好的應(yīng)用價(jià)值。而傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(yàn)需要在獲得細(xì)菌菌株后才能進(jìn)行，往往需要1個(gè)月以上的時(shí)間，遠(yuǎn)滯后于臨床需求。本研究中，61例Xpert Ultra檢測(cè)陽(yáng)性患兒中，5例檢測(cè)出利福平耐藥，但僅1例獲得了MGIT 960藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，且與Xpert Ultra檢測(cè)耐藥結(jié)果一致。這提示Xpert Ultra 檢測(cè)有助于臨床醫(yī)師快速獲得患兒利福平耐藥結(jié)果，為及時(shí)選擇合適的抗結(jié)核藥品提供了依據(jù)。

綜上，Xpert Ultra檢測(cè)胃液標(biāo)本對(duì)兒童肺結(jié)核診斷具有較好的敏感度和特異度，有助于兒童結(jié)核病的早期診斷。對(duì)于無(wú)法咳痰或者難以取得痰液標(biāo)本的學(xué)齡前患兒來(lái)說(shuō)，胃液標(biāo)本是很有價(jià)值的替代標(biāo)本類(lèi)型。