張振，李芳芳，王云龍，王同甫，梁冰，楊清樂，潘平

(南陽市第一人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)二科，河南 南陽 473000)

食管癌是危害全球人類健康的疾病之一，其發(fā)病率居于惡性腫瘤第9位，死亡率居于第6位[1]。我國2015年統(tǒng)計顯示，食管癌年新發(fā)病例47.79萬，預(yù)計死亡35.5萬人[2]。我國食管癌高發(fā)于華北太行山脈地區(qū)，主要病理類型為鱗狀細胞癌(簡稱鱗癌)，腺癌少見。近年來食管癌手術(shù)治療有很大進步，但進展期食管癌預(yù)后仍然較差，5 a生存率低于10%[3]。部分研究顯示一些指標(biāo)與食管鱗癌預(yù)后相關(guān)，但都不是腫瘤特異性的，且受多種因素影響[4-7]。作用于RNA的腺苷脫氨酶1(adenosine deaminases acting on RNA 1，ADAR1)可催化雙鏈RNA上的腺嘌呤轉(zhuǎn)換為次黃嘌呤(adenosine-to-inosine，A-to-I)，并將次黃嘌呤識別為鳥嘌呤，與胞嘧啶配對。ADAR1的編輯活性與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究檢測ADAR1在食管癌組織及癌旁正常組織中的表達，探討其與食管鱗癌臨床特征的關(guān)系及對預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料及標(biāo)本收集南陽市第一人民醫(yī)院2018年1—12月經(jīng)手術(shù)切除的36例新鮮食管癌組織及距離原發(fā)灶5 cm以上的癌旁正常組織，收集2014年1月至2016年1月102例術(shù)后食管鱗癌蠟塊。通過電話隨訪或返院復(fù)查，每3個月1次，記錄患者生存情況，末次隨訪時間為2019年11月1日。病例納入標(biāo)準：術(shù)前未接受放化療；手術(shù)為R0切除；病理類型為食管鱗癌；有完整的術(shù)后病理資料和臨床資料。排除標(biāo)準：腺鱗混合或其他病理類型食管癌；合并其他惡性腫瘤；術(shù)后出現(xiàn)吻合口瘺等嚴重并發(fā)癥。本研究經(jīng)南陽市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器TRIzol Reagent(15596018)購自上海索萊寶生物科技有限公司，Superscript Ⅲ Reverse Transcriptase Kit(18080044)購自美國Invitrogen公司，SYBR Green qPCR Master Mix(QR-SG-M200)購自上海薩博生物公司，ADAR1兔抗人一抗(FNab00150)購自上海北諾生物科技公司，羊抗兔二抗(WE0383-BMR)購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，DAB試劑盒(HR0342)購自北京百奧萊博科技公司，ADAR1與內(nèi)參GAPDH上下游引物由上海生工合成。實時熒光定量PCR儀QuantStudio DX購自Thermo Fisher Scientific。

1.3 RT-qPCR組織研磨后用TRIzol勻漿，加入氯仿進行相的分離，中間有機相析出后加入異丙醇進行RNA沉淀，加入體積分數(shù)75%的乙醇洗滌RNA，加入焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)水吹打溶解RNA，紫外分光光度計檢測RNA光密度(optical density，OD)值，測定RNA水平，-80 ℃冰箱保存。提取的組織總RNA用Superscript Ⅲ Reverse Transcriptase Kit試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，應(yīng)用SYBR Green qPCR Master Mix Kit進行實時熒光定量PCR。ADAR1上游引物為5’CCCTTCAGCCACATCCTTC3’，下游引物為5’GCCATCTGCTTTGCCACTT3’，內(nèi)參GAPDH上游引物為5’CATGAGAAGTATGACAACAGCCT3’，下游引物為5’AGTCCTTCCACGATACCAAAGT3’。擴增條件：95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40個循環(huán)。采用相對定量法比較癌組織與癌旁正常組織表達水平，計算方法采用2-ΔΔCt法。

1.4 免疫組織化學(xué)法石蠟切片進行脫蠟和水化，30 g·L-1的H2O2浸泡10 min后沖洗，0.5 mol·L-1乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)緩沖液煮沸20 min進行抗原修復(fù)，滴加體積分數(shù)10%的非免疫山羊血清孵育20 min進行封閉，滴加一抗工作液，4 ℃過夜孵育，滴加特異性二抗工作液，37 ℃孵育30 min，DAB試劑盒顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染1 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每個樣本取 4 個高倍視野，通過免疫組織化學(xué)半定量檢測得出陽性細胞百分比，以4個高倍視野均值為最終表達量。腫瘤組織的表達高于其相應(yīng)正常組織的表達為高表達，低于或與相應(yīng)正常組織表達水平相當(dāng)為正常表達。

2 結(jié)果

2.1 ADAR1在食管鱗癌及癌旁正常組織中表達情況對36例新鮮食管鱗癌術(shù)后組織標(biāo)本進行 RT-qPCR檢測顯示：ADAR1在癌組織中表達水平較癌旁正常組織高(t=2.271，P=0.026)，見圖1。免疫組織化學(xué)檢測顯示：ADAR1在細胞質(zhì)和細胞核中均有表達，在癌旁正常組織中呈弱陽性表達，在食管鱗癌中呈強陽性表達，見圖2。對免疫組織化學(xué)結(jié)果進行半定量處理，與RT-qPCR檢測結(jié)果進行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者呈正相關(guān)(r=0.806，P<0.01)。

圖1 RT-qPCR檢測ADAR1在食管鱗癌及癌旁 正常組織中的表達

A為癌旁正常組織，B為食管鱗癌組織。

圖2免疫組織化學(xué)法檢測ADAR1在食管鱗癌及癌旁

正常組織中的表達(蘇木精染色，×200)

2.2 ADAR1表達與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系通過免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)ADAR1表達增高與食管鱗癌患者性別、年齡、腫瘤部位、長度、分化程度無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤的浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 ADAR1表達與食管鱗癌術(shù)后臨床病理特征的關(guān)系

2.3 ADAR1表達對食管鱗癌患者術(shù)后生存率的影響ADAR1高表達和正常表達患者中位總生存期分別為25、 39個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)。見圖3。

圖3 ADAR1高表達與正常表達患者總生存情況比較

2.4 影響食管鱗癌患者術(shù)后總生存期的單因素和多因素分析將性別、年齡、部位、長度、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及ADAR1表達水平納入預(yù)后分析。單因素分析顯示：ADAR1表達水平、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是患者預(yù)后的影響因素，ADAR1正常表達、T1～2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者總生存期較長(P<0.05)。多因素分析顯示：ADAR1表達水平和腫瘤浸潤深度是食管鱗癌患者術(shù)后總生存的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響食管鱗癌患者術(shù)后預(yù)后的單因素和多因素分析

3 討論

ADAR1基因位于染色體1q，在哺乳動物大部分組織中均有表達，結(jié)構(gòu)高度保守，包括3個雙鏈RNA結(jié)合區(qū)和C端催化脫氨基結(jié)構(gòu)區(qū)[8]。ADAR1介導(dǎo)的A-to-I RNA編輯活動與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ADAR1可以作用于mRNA如AZIN1，增加肝癌和食管鱗癌細胞的侵襲性[9-10]，也可以作用于抑制腫瘤的miRNA如let-7家族，增加白血病干細胞的自我更新能力[11]。在多種腫瘤中，基因擴增是ADAR1水平升高的主要原因，同時也可以通過腫瘤慢性炎癥刺激干擾素信號通路誘導(dǎo)其水平升高。在慢性髓系白血病中，JAK-STAT信號通路和 BCR-ABL1表達能夠刺激干擾素信號通路，誘導(dǎo)ADAR1上調(diào)[11-12]，而JAK-STAT信號通路同樣參與食管鱗癌ADAR1上調(diào)[13]。在細胞培養(yǎng)基和動物實驗中，過度表達的ADAR1增強了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，而ADAR1基因的沉默或敲除能降低惡性特征。

本研究顯示，不論采用PCR還是免疫組織化學(xué)方法，食管鱗癌組織ADAR1表達水平均高于癌旁正常組織，且免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示ADAR1表達水平與食管鱗癌的浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，提示ADAR1可能為食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的促進因素。既往研究表明，在肝癌、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤中存在ADAR1高表達和更高頻率的A-to-I RNA編輯現(xiàn)象，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[14-15]。食管鱗癌是我國最常見的食管癌組織學(xué)類型，占97%，腺癌不到2%，與西方國家明顯不同[16]。食管鱗癌是環(huán)境、遺傳因素等交互作用和多階段演進的結(jié)果，DNA的突變和RNA的修飾均參與其發(fā)病過程。一些臨床指標(biāo)如中性粒細胞與淋巴細胞、血小板與淋巴細胞、C反應(yīng)蛋白與白蛋白的比值以及D-二聚體水平等與食管鱗癌預(yù)后有一定的相關(guān)性[4-7]，但受影響因素較多，都不是腫瘤特異性的。本研究通過生存分析發(fā)現(xiàn)，ADAR1的表達與食管鱗癌預(yù)后相關(guān)，陽性組中位生存期較短，多因素分析顯示ADAR1是食管鱗癌預(yù)后的獨立危險因素，提示其可以作為食管鱗癌預(yù)后的評估指標(biāo)。

本研究針對食管鱗癌預(yù)后的單因素分析發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度、ADAR1表達情況均與患者預(yù)后相關(guān)，多因素分析中只有浸潤深度和ADAR1是獨立危險因素。通過分析相關(guān)臨床資料，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)清掃不足且未進行區(qū)域劃分可能為部分原因。另外，本研究為回顧性研究，可能存在一定的偏倚。雖然在新鮮組織標(biāo)本中，RT-qPCR和免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果有很好的相關(guān)性，但由于前期新鮮組織標(biāo)本收集不足，預(yù)后分析只能應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測石蠟標(biāo)本，與RT-qPCR方法可能會存在一定的差異。另外手術(shù)T分期中，T1和T4比例較少，可能對研究結(jié)果有一定的影響，這些均需在后續(xù)研究中改進。對于ADAR1在食管鱗癌中的作用機制，需要進一步研究闡釋。