王 釗，包海軍

(徐州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，徐州 221000)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)后神經(jīng)細(xì)胞的損傷與修復(fù)一直是腦外傷學(xué)科領(lǐng)域的熱門(mén)課題，它不僅包括由直接外力導(dǎo)致的原發(fā)性損傷，還包括原發(fā)性損傷引起的活性氧應(yīng)激，神經(jīng)細(xì)胞的萎縮、肥大，水腫，炎癥等繼發(fā)性損傷[1-2]。創(chuàng)傷性腦損傷后自噬標(biāo)志物-自噬微管關(guān)聯(lián)蛋白輕鏈3(LC3)增加，自噬受損可能導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷[3]。腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK) 是對(duì)物質(zhì)和能量代謝敏感的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[4]。腦外傷后能量合成受到抑制，使用藥物5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-1H-咪唑-4-甲酰胺(AICAR)或二甲雙胍后促進(jìn)AMPK激活，對(duì)小鼠腦損傷后的空間記憶有顯著改善[5]。TBI后的小鼠表現(xiàn)出認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活，通過(guò)敲除受體相互作用蛋白(RIP3)可以促進(jìn)小鼠海馬中的AMPK磷酸化的激活，從而降低了星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡[6]。TBI引起的氧化應(yīng)激，破壞腦能量穩(wěn)態(tài)，并促進(jìn)神經(jīng)炎癥，這進(jìn)一步導(dǎo)致了神經(jīng)元退化和認(rèn)知功能障礙[7]。因此AMPK的激活可能是治療TBI后繼發(fā)性損傷炎癥的一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[8]。

有研究表明二甲雙胍可以通過(guò)抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ調(diào)控AMP/ATP，促進(jìn)LKB1蛋白激酶的磷酸化進(jìn)而激活A(yù)MPK[9]。TBI導(dǎo)致腦水腫、血腦屏障破壞、神經(jīng)功能缺失、前庭運(yùn)動(dòng)功能障礙和AMPK磷酸化水平降低。應(yīng)用二甲雙胍后可減輕大鼠腦水腫、改善血腦屏障和前庭運(yùn)動(dòng)功能障礙。二甲雙胍治療組p-AMPK/AMPK比值升高。復(fù)合物C組通過(guò)抑制AMPK破壞二甲雙胍的神經(jīng)保護(hù)作用研究提示二甲雙胍通過(guò)磷酸化AMPK抑制TBI介導(dǎo)的繼發(fā)性損傷，改善腦損傷后神經(jīng)行為功能[10]。還有研究表明二甲雙胍在慢性TBI后至少有5天的治療時(shí)間窗，在此期間，二甲雙胍以AMPK依賴性的方式促進(jìn)組織修復(fù)、抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成和小神經(jīng)膠質(zhì)的激活[11]。

臨床報(bào)道表明二甲雙胍除了具有降低血糖的作用外，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗炎活性。結(jié)果表明，二甲雙胍能顯著改善腦損傷大鼠的神經(jīng)功能缺損、腦水腫和神經(jīng)元凋亡。此外，二甲雙胍可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括腫瘤壞死抑制因子(TNF-抑制因子)、白介素1(IL-1)和白介素6(IL-6)抑制因子[12]。最近的證據(jù)表明AMPK/FoxO3a軸在細(xì)胞周期阻滯、凋亡和遷移中起關(guān)鍵作用[13]。在缺氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中，F(xiàn)oxO3a(叉頭蛋白O的亞型3a蛋白)表達(dá)上調(diào)，應(yīng)用AMPK特異性激活劑AICAR之后研究發(fā)現(xiàn)AMPK的激活促進(jìn)了FoxO3a的表達(dá)以及自噬相關(guān)基因ATG家族的轉(zhuǎn)錄[14]。脂多糖誘導(dǎo)的急性肝衰竭的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AMPK上調(diào)FoxO3a的表達(dá)激活自噬，能夠改善急性肝損傷，抑制炎癥的發(fā)生[15]。

綜上所述，AMPK的激活有利于應(yīng)對(duì)TBI后腦的能量危機(jī)，并具有一定的抑制炎癥的作用，F(xiàn)oxO3a的激活能夠直接促進(jìn)自噬相關(guān)基因ATG家族的轉(zhuǎn)錄和翻譯，二甲雙胍以直接或間接方式激活A(yù)MPK。現(xiàn)利用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)和熒光免疫學(xué)方法探究二甲雙胍是否通過(guò)AMPK/FoxO3a信號(hào)通路途徑來(lái)發(fā)揮對(duì)腦外傷炎癥的調(diào)控，驗(yàn)證二甲雙胍這一藥物除了可以降低血糖作用外，還發(fā)揮對(duì)炎癥因子的抑制作用，從而開(kāi)拓二甲雙胍藥理學(xué)作用價(jià)值，為二甲雙胍的臨床用藥打下實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康成年雄性C57BL/6小鼠(25～30 g)購(gòu)自徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)[SCXK(滬)2018-0006]。Tek-cre(T003764)小鼠和帶有FOXO3A-loxp/loxp序列的小鼠購(gòu)自南京生物醫(yī)學(xué)研究所(中國(guó)南京)，動(dòng)物許可證號(hào)[SCXK(蘇)2015-0001]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)藥物：二甲雙胍(metformin，10 g)和復(fù)合物C(Dorsomorphin dihydrochloride，Compound C,10 mg)購(gòu)自MCE公司。主要抗體：兔抗小鼠FoxO3a(75D8)、兔抗小鼠P-FoxO3a(Ser253)、兔抗小鼠P-AMPKα(D4D6D)、兔抗小鼠NLRP3(D4D8T)、兔抗小鼠IL-1β(D4T2D)、鼠抗小鼠LC3β(E5Q2K)均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；兔抗小鼠LC3β(18725-1-AP)、HRP-山羊抗兔(二抗)、HRP-山羊抗鼠(二抗)、Coralite488驢抗兔(SA00013-6)、Coralite594驢抗鼠(SA00013-7)均購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group公司；兔抗小鼠IL-1β(ab9722)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。組織細(xì)胞裂解液(RIPA)、蛋白酶抑制劑(PMSF)和磷酸酶抑制劑均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因敲除小鼠的篩選與鑒定

FoxO3a-loxp/loxp序列的小鼠與Tek-cre小鼠交配產(chǎn)生子一代，子一代小鼠通過(guò)自交的方法產(chǎn)生子二代。在子二代小鼠中按照以下引物序列對(duì)小鼠后代進(jìn)行PCR基因鑒定：對(duì)于FoxO3a引物，正向，5′-CTGATACCGAAGAGCCTTGC-3′，反向，5′-CTTCCAAACAGAACCTTGTCC-3′；對(duì)于Tek-cre引物，正向，5′-ATTTGCCTGCATTACCGGTC-3′，反向，5′-ATCAACGTTTTCTTTTCGG-3′。篩選出FoxO3a-loxp/loxp/Tek+的小鼠后，根據(jù)徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的方案和標(biāo)準(zhǔn)，將小鼠維持在無(wú)特殊病原體的環(huán)境下生存。

1.2.2 TBI模型的建立

采用3.5%水合氯醛按照每10 g小鼠體重注射0.1 mL的劑量腹腔注射進(jìn)行麻醉。采用改良的Feeney’s自由落體模型裝置制作小鼠TBI模型。骨鉆在顱骨冠狀縫后2.5 mm，偏離顱骨中線左側(cè)1.5 mm處鉆一直徑5 mm孔洞，在開(kāi)顱的過(guò)程中保持硬腦膜的完整。自由落體的裝置快速撞擊硬腦膜，實(shí)驗(yàn)中所用的砝碼質(zhì)量200 g，高度30 cm。撞擊柱直徑5 mm，撞擊硬腦膜面的下降高度小于4 mm，撞擊接觸時(shí)間0.01 ms?？p合頭皮[16]。偽手術(shù)組僅剪開(kāi)頭皮，骨鉆去除顱骨暴露硬腦膜，縫合傷口。取損傷側(cè)的大腦皮質(zhì)，稱(chēng)量并記錄。

1.2.3 動(dòng)物給藥

二甲雙胍以150 mg/kg的劑量在8:00和20:00灌胃給藥，對(duì)照組給予同樣劑量的生理鹽水[17]。持續(xù)給藥7 d，第8天在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)建立小鼠TBI模型。復(fù)合物C組采取腹腔注射的方法，按照20 mg/kg的劑量在TBI前1 h腹腔注射，對(duì)照組給予同樣劑量的生理鹽水[18]。

1.2.4 Western blot檢測(cè)

取損傷側(cè)大腦皮質(zhì)，稱(chēng)重并按照10 mL/mg加入組織蛋白裂解提取液。按照細(xì)胞組織裂解液:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑=100:1:1(質(zhì)量比)混合后加入。勻漿，存放在4 ℃層析柜中裂解30 min，13 000 r/min離心15 min，吸取上清液。(BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃保溫15 min以充分變性。-20 ℃保存待用。配制SDS-PAGE凝膠，電泳分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 免疫熒光雙染

鼠腦整體取出后放入4%多聚甲醛溶液固定 12 h，經(jīng)20%、30%蔗糖溶液脫水至沉底。冰凍切片，切片厚度20 μm，切片放于-20 ℃保存，使用時(shí)復(fù)溫30 min。在切片上滴加0.3% TritonX-100溶液，10%驢血清封閉。兩個(gè)一抗(封閉血清稀釋)混合后涂片，4 ℃層析過(guò)夜。熒光素標(biāo)記的二抗混合，然后涂片。室溫孵育2 h(從這一步開(kāi)始避光)，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗5 min共3次，滴加4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)染液。封片，避光觀察。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 二甲雙胍對(duì)AMPK、自噬及炎癥因子表達(dá)的影響

二甲雙胍組和生理鹽水組相關(guān)蛋白Western Blot檢測(cè)結(jié)果如圖1～圖3所示。與生理鹽水組相比，二甲雙胍組p-AMPK表達(dá)增加，p-FoxO3a表達(dá)降低[圖1(a)、圖1(c)]。p-AMPK/AMPK的比值增加，p-FoxO3a/FoxO3a的比值降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)顯示在TBI后的6、12、24 h具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[圖1(b)、圖1(d)]。自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增高，p62表達(dá)降低[圖2(a)]，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)顯示在TBI后6、12 h具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[圖2(b)、圖2(c)]。在TBI后6、12 h，炎癥因子NLRP3、IL-1β表達(dá)降低[圖3(a)]，且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)顯示在TBI后6、12 h具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[圖3(b)、圖3(c)]。由此證明二甲雙胍可以促進(jìn)AMPK的磷酸化，抑制FoxO3a磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)自噬的發(fā)生，對(duì)炎癥因子起到了一定的抑制作用。

圖1 p-AMPK、AMPK、p-FoxO3a、FoxO3a蛋白表達(dá)程度及相對(duì)蛋白表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Fig.1 The expression levels of p-AMPK, AMPK, p-FoxO3a and FoxO3a, and the statistical analysis of the relative protein expressions

圖2 自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ及P62蛋白表達(dá)程度及相對(duì)蛋白表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Fig.2 Autophagy related proteins LC3 -Ⅱ, LC -Ⅰ and P62 protein expression level, and the statistical analysis of the relative protein expression

圖3 炎癥相關(guān)因子IL-1β、NLRP3蛋白表達(dá)程度及相對(duì)蛋白表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Fig.3 Inflammation of the related factor IL-1β, NLRP3 protein expression level, and the statistical analysis of the relative protein expression

2.2 Compound C對(duì)TBI后AMPK、FoxO3a及自噬水平的影響

Compound C 為一種特異性AMPK磷酸化水平抑制劑，選取TBI后12 h的動(dòng)物模型，建立Compound C組和生理鹽水組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4、圖5所示。與生理鹽水組相比較，使用Compound C后AMPK的磷酸化水平降低，p-FoxO3a的磷酸化水平升高[圖4(a)]，p-AMPK/AMPK、p-FoxO3a/FoxO3a在TBI后12 h具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[圖4(b)、圖4(c)]。自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，P62蛋白表達(dá)水平相反[圖5(a)]，且數(shù)據(jù)學(xué)分析顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[圖5(b)、圖5(c)]。由此證明FoxO3a受AMPK磷酸化水平的調(diào)節(jié)。p-AMPK表達(dá)降低后抑制FoxO3a轉(zhuǎn)錄進(jìn)入細(xì)胞核。AMPK活化被抑制后同時(shí)抑制自噬發(fā)生。

2.3 免疫熒光檢測(cè)野生型組和基因敲除組TBI后自噬及炎癥因子的表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。與野生型小鼠相比較，F(xiàn)oxO3a基因敲除組小鼠自噬水平明顯降低，而炎癥因子的表達(dá)水平明顯增高。自噬標(biāo)志蛋白LC3主要集中分布在細(xì)胞質(zhì)，而炎癥因子IL-1β在整個(gè)細(xì)胞均有分布[圖6(a)]。LC3及IL-1β免疫熒光強(qiáng)度采用Image J檢測(cè)并經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示野生型組和基因敲除組小鼠在TBI后12 h具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[圖6(b)]。由此進(jìn)一步證實(shí)TBI后FoxO3a能夠促進(jìn)自噬的發(fā)生，進(jìn)而對(duì)炎癥因子起到抑制作用。

圖4 腹腔注射Compound C后p-AMPK、AMPK、p-FoxO3a、FoxO3a蛋白表達(dá)程度及相對(duì)蛋白表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Fig.4 The expression levels of p-AMPK, AMPK, p-FoxO3a and FoxO3a after Compound C intraperitoneal injection, and the statistical analysis

圖5 腹腔注射Compound C后自噬相關(guān)蛋白表達(dá)程度及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Fig.5 Expression level and statistical analysis of autophagy related proteins after Compound C intraperitoneal injection

藍(lán)色代表細(xì)胞核；紅色代表LC3；綠色代表IL-1β圖6 基因敲除組和野生型組免疫熒光染色檢測(cè)及熒光染色陽(yáng)性百分比統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分析Fig.6 Immunofluorescence staining detection and statistical analysis of the percentage of positive fluorescence staining in the knockout group and the wild-type group

3 討論分析

腦內(nèi)長(zhǎng)期代謝抑制是創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的一種典型的繼發(fā)性病理現(xiàn)象。通過(guò)增加能源或提供代替能源的化合物(如三乙酸甘油酯、乙酰左旋肉堿)可以改善預(yù)后[19]。AMPK作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在能量低的狀態(tài)下被激活[20]。中度至重度創(chuàng)傷性腦損傷會(huì)降低AMPK的活性，而損傷后AMPK的激活可以改善空間記憶[21]。AMPK 在 6 個(gè)調(diào)節(jié)位點(diǎn) (Thr179、Ser399、Ser413、Ser355、Ser588、Ser626) 直接磷酸化 FoxO3a，增強(qiáng) FoxO3a 轉(zhuǎn)錄活性[22]。FoxO3a缺陷小鼠 NF-κB 轉(zhuǎn)錄活性明顯增強(qiáng)，在 FoxO3a 基因敲除小鼠中，TNF-α誘導(dǎo)的HT29細(xì)胞中促炎因子水平顯著增加[23]。FoxO3a調(diào)節(jié)的自噬在發(fā)炎的人牙髓和脂多糖處理的 mDPC6T細(xì)胞中抗炎作用的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3a細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)與炎癥進(jìn)展呈正相關(guān)。FoxO3a可能在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和炎癥調(diào)控中發(fā)揮作用[24]。前期相關(guān)的課題實(shí)驗(yàn)證實(shí)了二甲雙胍可以通過(guò)抑制FoxO3A的磷酸化促 進(jìn)自噬的發(fā)生，進(jìn)而抑制TBI后小鼠大腦皮質(zhì)炎癥因子的表達(dá)[25]。此外在骨骼肌蛋白代謝的調(diào)節(jié)中發(fā)現(xiàn)AMPK促進(jìn)FoxO3a的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞自噬的發(fā)生[26]。表明AMPK/FoxO3a途徑在多種新陳代謝中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

二甲雙胍的抗炎途徑除了通過(guò)激活A(yù)MPK途徑，還可以通過(guò)抑制胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)途徑以及NF-κB信號(hào)的滅活途徑來(lái)抑制炎癥。在研究老年人急性肺損傷(ALI)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可能通過(guò)AMPK信號(hào)通路進(jìn)而抑制脂多糖誘導(dǎo)下的老齡小鼠ALI中NLRC4炎癥小體的激活[27]。同時(shí)在脂肪毒性誘導(dǎo)細(xì)胞和高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK活性，減少脂肪毒性誘導(dǎo)的細(xì)胞間的炎癥反應(yīng)[28]。

通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)的方法探究創(chuàng)傷性腦損傷后二甲雙胍對(duì)自噬和炎癥的調(diào)控機(jī)制，應(yīng)用二甲雙胍(AMPK的激動(dòng)劑)和Compound C(AMPK的抑制劑)從正反兩方驗(yàn)證AMPK對(duì)FoxO3a的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)應(yīng)用FoxO3a基因敲除小鼠免疫熒光雙染的方法探究FoxO3a與自噬標(biāo)志蛋白LC3和炎癥因子IL-1β的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：AMPK的激活和FoxO3a蛋白有利于自噬的發(fā)生，自噬的發(fā)生起到了對(duì)腦外傷后大腦皮質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終證明二甲雙胍通過(guò)AMPK/FoxO3a信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)TBI后炎癥因子的抑制作用，p-AMPK的激活促進(jìn)FoxO3a的轉(zhuǎn)錄翻譯，促進(jìn)自噬體的形成。二甲雙胍除了可以降低腦外傷后的血糖異常升高外，對(duì)腦外傷后的炎癥因子還起到了一定的抑制作用。實(shí)驗(yàn)存在的不足之處僅在體實(shí)驗(yàn)不能證明二甲雙胍直接作用于AMPK/FoxO3a信號(hào)通路途徑，還需要通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步探究。