田苗，范夢(mèng)璐，鄭一青，平繼輝

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)屬于A型流感病毒，可引起絕大多數(shù)家禽、野鳥感染，甚至可以跨越宿主屏障，感染包括人在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物[1]。根據(jù)A型流感病毒表面蛋白HA和NA的差異，可分成18種HA亞型(H1～H18)和11種NA亞型(N1～N11)，不同HA、NA亞型之間可相互組合產(chǎn)生重組病毒[2]。1966年在火雞中分離出第1株H9N2亞型AIV，1994年在廣東病雞體內(nèi)分離出國內(nèi)第1株H9N2毒株，之后該亞型AIV迅速在全國蔓延。1997年香港地區(qū)發(fā)生禽流感感染人事件，H9N2為感染人的H5N1提供內(nèi)部基因。1998年以后，H9N2病毒在我國偶爾傳染給家豬等哺乳動(dòng)物，甚至人類，導(dǎo)致輕微的呼吸道疾病。2013年從湖南男童身上分離到1株H9N2病毒，屬于S基因型、Y280譜系[3]。迄今為止，已確診的H9N2感染人事件已超過39例[4]，表明部分H9N2病毒已具有感染人的能力。因此，H9N2亞型AIV的傳播不僅具有大流行潛力，也是一個(gè)潛在的公共衛(wèi)生問題。

目前國內(nèi)H9N2亞型AIV的防控主要依靠滅活疫苗免疫，但是AIV在疫苗選擇壓力下正在不斷發(fā)生變異、重組，有效地控制其流行傳播難度巨大[5]。因此，系統(tǒng)監(jiān)測(cè)H9N2病毒并進(jìn)行及時(shí)疫苗更新，對(duì)科學(xué)防控AIV具有重要科學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)室于2019年在江蘇地區(qū)分離到2株H9N2亞型AIV，進(jìn)行全基因組測(cè)序，開展了遺傳演化分析及其對(duì)小鼠的致病性研究，旨在為防控H9N2亞型禽流感提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株

2株H9N2亞型AIV：A/chicken/Jiangsu/25/2019(H9N2)，簡稱CK/JS/25/19和A/chicken/Jiangsu/43/2019(H9N2)，簡稱CK/JS/43/19，2019年分離自江蘇某養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑、DNA聚合酶及其Buffer和分子量Marker，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；胎牛血清，購自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)液，購自Thermo Fisher公司。

1.3 雞胚及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

9～10日齡的SPF雞胚購自南京天邦生物科技有限公司。6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.4 病毒的分離與鑒定

采集病雞的泄殖腔拭子和喉拭子，加入滅菌PBS處理后離心取上清，過濾除菌后經(jīng)尿囊腔接種9～10日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。24 h內(nèi)死亡的雞胚直接高壓棄掉，收獲24～96 h死胚和活胚的尿囊液進(jìn)行血凝測(cè)定，陰性者再盲傳3代。血凝檢測(cè)呈陽性判定該樣品為病毒分離陽性，通過血凝抑制試驗(yàn)來確定尿囊液中病毒亞型。

1.5 病毒的純化與增殖

將上述收獲的尿囊液按10-4～10-10有限稀釋度接種9～10日齡SPF雞胚，收獲有血凝價(jià)且最高稀釋度的尿囊液作為下一次接種材料，3次有限稀釋進(jìn)行病毒純化增殖，測(cè)定病毒的血凝價(jià)，分裝置于-80 ℃保存，半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)測(cè)定病毒滴度。

1.6 病毒的基因組提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

提取病毒的總RNA，利用流感病毒基因組的通用引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，上游引物U12：5′-CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGG-3′；下游引物U13：5′-CACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGG-3′。使用基因特異性引物分別擴(kuò)增流感病毒的8個(gè)基因片段，PB2、PB1、PA基因序列分2段進(jìn)行擴(kuò)增，HA、NP、NA、NS、M基因直接擴(kuò)增全長。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定，送通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司測(cè)序。

1.7 序列分析及繪制進(jìn)化樹

測(cè)序結(jié)果使用Lasergene 9.0軟件套裝中的SeqMan軟件進(jìn)行序列拼接，通過NCBI的BLAST功能比對(duì)分析，使用MegAlign軟件分析各個(gè)基因片段的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性，使用Mega 7.0.26軟件繪制病毒各個(gè)基因的進(jìn)化樹，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)分析分離株的關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn)。主要的H9N2代表性毒株：BJ/94即A/chicken/Beijing/1/1994(H9N2)，SD/6即A/chicken/Shandong/6/1996(H9N2)，Y280即A/duck/Hong Kong/Y280/1997(H9N2)，G1即A/quail/Hong Kong/G1/1997(H9N2)，G9即A/chicken/Hong Kong/G9/1997(H9N2)，Y439即A/duck/Hong Kong/Y439/1997(H9N2)，F(xiàn)/98即A/chicken/Shanghai/F/1998(H9N2)，HK/1073即A/Hong Kong/1073/1999(H9N2)，HK/33982即A/Hong Kong/33982/2009(H9N2)。

1.8 小鼠致病性研究

將6～8周齡的BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組5只，異氟醚麻醉小鼠，其中2組通過滴鼻方式接種病毒，105TCID50/小鼠，每只50 μL，剩余1組使用PBS進(jìn)行滴鼻作為對(duì)照組。對(duì)照組和攻毒組每天正常飼喂，在每天同一時(shí)間稱量小鼠的體重，連續(xù)稱量14 d。

1.9 病毒的聚合酶活性分析

分別將2株分離株的聚合酶(PB2、PB1和PA)和NP基因片段克隆到pCAGGS載體上構(gòu)建真核蛋白表達(dá)質(zhì)粒，與螢火蟲熒光報(bào)告基因質(zhì)粒和海腎熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人源293T細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。48 h后，預(yù)冷的PBS潤洗細(xì)胞2次，加入適量的細(xì)胞裂解液，充分裂解后，12 000 r/min離心3～5 min，取上清用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，計(jì)算二者比值，分析聚合酶活性的差異。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)組之間差異統(tǒng)計(jì)顯著性使用GraphPad Prism 8.0.1軟件Studentt檢驗(yàn)確定，數(shù)據(jù)表示方式為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的分離鑒定與增殖

本研究從我國江蘇地區(qū)分離得到2株AIV分離株，CK/JS/25/19和CK/JS/43/19，血凝價(jià)均為6log2。2株分離株8個(gè)基因片段PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期相符，血凝抑制試驗(yàn)和測(cè)序結(jié)果表明分離株為H9N2亞型AIV。利用雞胚3次有限稀釋純化并增殖后，血凝價(jià)分別為9log2和8log2；TCID50測(cè)定病毒滴度，前者為107.613±0.098TCID50/mL，后者為106.647±0.137TCID50/mL。

2.2 序列同源性比較

毒株CK/JS/25/19與CK/JS/43/19的各基因核苷酸同源性為94.0%～98.4%，推導(dǎo)出的各基因氨基酸同源性為96.0%～100%，表明2株分離株的各基因具有較高的同源性。與H9N2代表性毒株相比，各基因核苷酸同源性較低，尤其是HA基因，其核苷酸和氨基酸同源性分別為78.0%～88.8%、84.2%～90.8%，具體結(jié)果見表1、表2。

表1 CK/JS/25/19、CK/JS/43/19與H9N2代表性毒株的核苷酸同源性分析 %

表2 CK/JS/25/19、CK/JS/43/19與H9N2代表性毒株的氨基酸同源性分析 %

2.3 遺傳演化分析

根據(jù)2株H9N2分離株以及NCBI所獲得的代表性毒株的核苷酸序列，使用Mega 7.0.26軟件繪制病毒8個(gè)基因的進(jìn)化樹，結(jié)果如圖1、2所示。2株分離株各個(gè)基因均屬于相同分支，且與江蘇、浙江、安徽等地的分離株親緣關(guān)系較近。其中，HA、NA基因位于Y280分支，PB2、M基因位于G1分支，PB1、PA、NP、NS基因位于F/98分支。

進(jìn)化樹樹根為A/turkey/Wisconsin/1966(H9N2)；■表示本研究中使用的分離株，●表示經(jīng)典疫苗株。下同

圖2 CK/JS/25/19、CK/JS/43/19分離株的NA、NP、M、NS基因的遺傳演化分析

2.4 關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn)分析

2.4.1 HA基因受體結(jié)合位點(diǎn)和裂解位點(diǎn)分析

分析HA基因受體結(jié)合位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)(表3)，2株H9N2分離株受體結(jié)合位點(diǎn)91、143、145、184、185位(H9編碼，下同)均較為保守，與BJ/94、Y280、G1、F/98等代表性毒株保持一致。受體結(jié)合右緣128～132位點(diǎn)出現(xiàn)K131N、K131T突變；受體結(jié)合左緣214～219位點(diǎn)中，216位點(diǎn)與疫苗株不同，均為L，且均出現(xiàn)Q217M突變。2株分離株的裂解位點(diǎn)位于317～323，序列均為RSSR↓GLF，符合低致病性AIV的基本特征。

表3 CK/JS/25/19與CK/JS/43/19的HA受體結(jié)合位點(diǎn)和裂解位點(diǎn)分析

2.4.2 HA基因抗原性相關(guān)位點(diǎn)分析

H9亞型AIV HA的關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn)影響其抗原性。121、249位點(diǎn)較為保守，2株分離株均為121I、249I，與疫苗株SD/6和F/98一致。但與疫苗株相比，均存在G72E、S/T127D、D135G、T182R、T195A、D198E、Q216L、N264K突變，CK/JS/25/19存在K131N突變，CK/JS/43/19出現(xiàn)K131T、N183G突變(表4)。

表4 CK/JS/25/19與CK/JS/43/19的HA基因抗原性相關(guān)位點(diǎn)分析

2.4.3 HA和NA基因的潛在糖基化位點(diǎn)分析

本研究中2株分離株潛在糖基化位點(diǎn)無差異，HA存在7個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)(表5)，即11、123、280、287、295、474、533；NA存在6個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)(表6)，即69、86、146、200、234、368。與代表性毒株BJ/94、Y280、G1、F/98等相比，大部分位點(diǎn)較為保守，HA295位、NA368位出現(xiàn)潛在糖基化位點(diǎn)，HA200位、NA402位缺失潛在糖基化位點(diǎn)。

2.4.4 致病性相關(guān)位點(diǎn)分析

AIV各基因特定氨基酸位點(diǎn)的突變可以顯著影響其致病性。2株H9N2毒株的PB2基因均未發(fā)生E627K、D701N突變，但CK/JS/43/19出現(xiàn)E627V突變形式。CK/JS/25/19的PB2基因發(fā)生A588V突變，CK/JS/43/19發(fā)生A588T突變，二者均存在PA基因K356R突變、NA基因63～65位缺失、M2上S31N突變(表7)。

表5 CK/JS/25/19與CK/JS/43/19 HA基因的潛在糖基化位點(diǎn)分析

表6 CK/JS/25/19與CK/JS/43/19 NA基因的潛在糖基化位點(diǎn)分析

表7 CK/JS/25/19與CK/JS/43/19的致病性相關(guān)位點(diǎn)分析

2.5 對(duì)小鼠的致病性分析

分離株CK/JS/25/19接種小鼠后，小鼠均未死亡，且未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀；分離株CK/JS/43/19接種小鼠后，雖然小鼠均未死亡，但感染3 d后，小鼠出現(xiàn)臨床癥狀，表現(xiàn)為精神沉郁、行動(dòng)遲緩、縮頭、被毛凌亂，與對(duì)照組相比體重出現(xiàn)下降，在感染后第6天大約下降10%的體重，8 d后逐漸恢復(fù)正常(圖3)。

圖3 小鼠感染H9N2亞型AIV后體重變化

2.6 聚合酶活性測(cè)定

通過構(gòu)建2株病毒聚合酶和NP基因的蛋白表達(dá)質(zhì)粒，并測(cè)定2株分離株的聚合酶活性，結(jié)果顯示，CK/JS/43/19聚合酶活性是CK/JS/25/19的6.7倍，P<0.001(圖4)。

***表示P<0.001

3 討論

目前，國內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)H9N2亞型AIV的遺傳進(jìn)化及生物學(xué)特性進(jìn)行了大量研究。Xia等[6]發(fā)現(xiàn)2013—2016年我國西南地區(qū)家禽H9N2亞型AIV部分分支已發(fā)生顯著的抗原性變化。蔣大秀[7]發(fā)現(xiàn)2016—2018年華東地區(qū)H9N2亞型AIV G57基因型占主導(dǎo)。本研究所分離的2株H9N2亞型AIV符合當(dāng)前H9N2亞型AIV的流行趨勢(shì)，與代表性毒株BJ/94、Y280相比，除M、NS基因外，核苷酸序列同源性均在90%以下；與經(jīng)典疫苗株SD/6、F/98相比，HA氨基酸序列差異較大，表明2株分離株存在不同程度的進(jìn)化差異。

HA裂解位點(diǎn)的氨基酸序列特征是決定AIV致病性的重要因素之一。大部分高致病性AIV在HA裂解位點(diǎn)附近含有多個(gè)堿性氨基酸，可被細(xì)胞內(nèi)多種蛋白酶所識(shí)別和裂解，而引起全身多器官感染；低致病性AIV通常僅存在單個(gè)堿性氨基酸，僅被存在于呼吸道和消化道內(nèi)的精氨酸特異蛋白酶識(shí)別和水解，因此呈局部感染。本研究中2株分離株HA裂解位點(diǎn)均為RSSR↓GLF，符合低致病性AIV的特征。

HA結(jié)合唾液酸受體的能力與AIV跨物種傳播密切相關(guān)，通常人流感病毒傾向與α-2,6唾液酸受體結(jié)合，而AIV主要與α-2,3受體結(jié)合[8]。受體結(jié)合位點(diǎn)及其周圍氨基酸的改變可能會(huì)改變病毒的受體結(jié)合特性，已報(bào)道I145T、H173N、Q216L突變形式可以促使病毒更好的結(jié)合α-2,6唾液酸受體[9]。本研究2株分離株145、173、216位點(diǎn)分別為T、N、L，具有感染人的潛在危險(xiǎn)。

禽流感之所以難以防控，主要是因?yàn)橐呙绺滤俣入y以跟上病毒的變異速度。有研究表明HA上G72E、K131N、D135G、A180E/T/V、T182R、A195T、D/T198N、L216Q、K264N等氨基酸位點(diǎn)的改變會(huì)引起抗原性發(fā)生變化[10]，與經(jīng)典疫苗株SD/6、F/98相比，分離株的HA在這些位點(diǎn)存在上述差異形式，表明抗原性可能發(fā)生不同程度的改變。

HA、NA上潛在糖基化位點(diǎn)的增加或減少可以影響病毒的生物學(xué)特性。本研究中，2株分離株潛在糖基化位點(diǎn)符合國內(nèi)流行規(guī)律，與BJ94、Y280等代表性毒株相比，增加HA295位、NA368位，缺失HA200位、NA402位。

8個(gè)片段上某些特定氨基酸位點(diǎn)的突變也是影響AIV致病性的重要因素之一[11]。例如，PB2的I292V、A588V/I，PB1的K577E，PA的K356R可增強(qiáng)病毒聚合酶活性，促進(jìn)病毒在小鼠中的復(fù)制[12-14]；HA的148位點(diǎn)也與致病性相關(guān)，D148N可增強(qiáng)對(duì)小鼠的致病性[15]。CK/JS/25/19、CK/JS/43/19毒株P(guān)B2的588位點(diǎn)分別為V、I，PA的356位點(diǎn)為R，HA的148位點(diǎn)均為N，推測(cè)可能具有增強(qiáng)對(duì)哺乳動(dòng)物致病性的可能性。CK/JS/43/19毒株627位點(diǎn)為V，雖不及E627K、D701N作用顯著，但研究報(bào)道表明該突變也能夠顯著增強(qiáng)病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的聚合酶活性，并增強(qiáng)對(duì)小鼠的致病性[16]，這也與本研究中的小鼠致病性和聚合酶活性試驗(yàn)結(jié)果相符合。NA的63～65位點(diǎn)缺失，有研究證明可增強(qiáng)病毒對(duì)雞的致病性[17]。M2上31位點(diǎn)與病毒耐藥性有關(guān)[18]，分離株均發(fā)生S31N突變，推測(cè)可能對(duì)金剛烷胺類等藥物已產(chǎn)生耐藥性。

目前，世界范圍內(nèi)已分離到超過39株人源H9N2毒株，因此研究其對(duì)哺乳動(dòng)物的致病性具有重要的公共衛(wèi)生意義。本研究發(fā)現(xiàn)CK/JS/43/19對(duì)小鼠具有致病性，推測(cè)部分H9N2毒株已獲得感染哺乳動(dòng)物的潛力。在人源293T細(xì)胞上測(cè)定H9N2分離株的聚合酶活性，與小鼠致病性結(jié)果一致，表明2株分離株存在致病性差異，具體是某個(gè)或某幾個(gè)氨基酸位點(diǎn)決定致病性差異有待深入研究。