劉禹辰 劉丹 鄭駿年 施明

程序性死亡受體-配體1（programmed death li?gand-1，PD-L1）也稱為表面抗原分化簇274（cluster of differentiation 274，CD274）或B7 同源體（B7 homo?log 1，B7-H1），是B7家族成員之一，其編碼基因位于染色體9p24.1，包含7個外顯子。PD-L1屬于Ⅰ型跨膜蛋白，由290個氨基酸組成，包含Ig-V和Ig-C樣胞外區(qū)、跨膜區(qū)和不含典型信號基序的短胞質尾巴。1999年12月，陳列平教授首次發(fā)現(xiàn)PD-L1（B7-H1）分子，并報道其可以促進T細胞增殖及分泌白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）［1］。日本學者本庶佑（Tasuku Honjo）課題組報道PD-L1 可與程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）相互作用并負調控淋巴細胞活化［2］。陳列平課題組先后報道腫瘤細胞表達的PD-L1 可誘導T 細胞凋亡，阻斷PD-L1 可增強T 細胞免疫治療的療效［3-4］。目前，已有3個抗PD-L1抗體獲批上市用于治療多種腫瘤［5］。

高表達PD-L1是腫瘤細胞逃逸免疫系統(tǒng)監(jiān)視和攻擊的重要途徑。因此，PD-L1表達調控的機制是腫瘤研究領域的熱點之一。已有研究表明PD-L1表達水平受到多種因素影響。作為蛋白分子，PD-L1可發(fā)生糖基化、泛素化、磷酸化、棕櫚?；约耙阴；刃揎棧@些翻譯后修飾（posttranslational modifications，PTMs）對PDL1的穩(wěn)定性及生物學功能產(chǎn)生重要影響（圖1）。

1 PD-L1的糖基化

1.1 PD-L1糖基化機制

作為一種重要的翻譯后修飾形式，糖基化對蛋白質分子的穩(wěn)定性、定位和功能起著重要作用。根據(jù)聚糖結構連接的氨基酸不同，蛋白質的糖基化修飾主要分為N-糖基化與O-糖基化兩種類型。

N-糖基化是在寡糖轉移酶復合體的催化下，將由寡糖預形成的糖鏈轉移到位于NXT 基序（天冬氨酸-X-色氨酸/絲氨酸序列，X為除脯氨酸外的任何氨基酸）中的天冬酰胺側鏈受體上，隨著肽鏈進入內質網(wǎng)腔和高爾基體，N-糖鏈繼續(xù)被糖苷酶和糖基轉移酶進一步加工修剪，形成最終的糖蛋白。

N-糖苷酶F（peptide-N-glycosidase F，PNGase F）可去除N-糖基化修飾。有研究［6］采用PNGase F 或N-糖基化抑制劑衣霉素（tunicamycin）處理MDAMB-231 細胞和BT549 細胞后，將全細胞裂解物進行Western-blot 檢測，PD-L1 的分子量由45 kDa 下降到33 kDa，但O-糖苷酶卻不能產(chǎn)生類似效應。這說明PD-L1 的糖基化類型主要是N-糖基化，根據(jù)聚糖鏈的組成不同，N-糖基化又可分為高甘露糖型、復雜型和雜交型。內切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶-H（endobeta-N-acetylglucosaminidase H，Endo-H）能裂解高甘露糖型和一些雜交型結構，當用Endo-H處理細胞后，僅部分降低PD-L1糖基化，說明PD-L1的糖基化類型主要是復雜型N-糖基化。該研究通過點突變的方法證實了PD-L1 的糖基化位點是N35、N192、N200、N219，見圖1。

圖1 PD-L1翻譯后修飾模式圖

已報道的PD-L1糖基轉移酶包括星狀孢子素溫度敏感性酶3（staurosporine and temperature sensitivity 3，STT3）［7］和β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶（β-1，3-N-acetylglucosaminyl transferase，B3GNT3）［8］。STT3是內質網(wǎng)相關的N-糖基轉移酶，敲除STT3后，PD-L1的糖苷結構消失，僅存在33 kDa的非糖基化形式，說明PDL1 4個糖基化位點均需在STT3的催化下才能發(fā)生糖基化修飾。B3GNT3是高爾基體相關糖基轉移酶，可以在PD-L1的N192和N200位點催化多聚-乙酰乳糖胺糖基化修飾。蛋白質分子折疊為糖基化的重要步驟，F(xiàn)K506結合蛋白51剪接體（FKBP51s）作為PD-L1的伴侶分子，通過在內質網(wǎng)中輔助PD-L1折疊，從而促進PD-L1的糖基化，穩(wěn)定膠質瘤中的PD-L1［9］。整合膜支架蛋白（Sigma1）在內質網(wǎng)處調節(jié)PD-L1的糖基化，阻止PD-L1的自噬降解從而穩(wěn)定腫瘤細胞中PD-L1［10］。

1.2 糖基化對PD-L1的影響

糖基化可影響PD-L1的穩(wěn)定性［6］。研究發(fā)現(xiàn)［6］，在PD-L1的4個糖基化位點中，僅N192、N200和N219這3個位點的糖基化會影響PD-L1的穩(wěn)定性。這3個位點發(fā)生糖基化會抑制PD-L1 與糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）結合以及隨后的蛋白酶體途徑降解。亦有研究報道，抑制介導PD-L1糖基化修飾的關鍵分子，如STT3［7］、B3GNT3［8］、Sigma1［10］和FKBP51s［9］，可顯著降低PD-L1的表達水平。

糖基化可影響PD-L1與PD-1之間的相互作用。PD-L1的4個糖基化位點均位于胞外區(qū)［6］。研究者［6］在人乳腺癌細胞BT549中敲低內源性PD-L1，然后在細胞中回轉野生型PD-L1（可糖基化PD-L1，gPD-L1）和4個糖基化位點突變的PD-L1突變體（不能糖基化的PD-L1，ngPD-L1）。結果顯示，與ngPD-L1相比，gPD-L1與PD-1的結合更強。而使用糖基化抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxyglucose，2-DG）［11］或者1-（4-碘苯基）-3-（2-金剛烷基）胍（1-（4-iodophenyl）-3-（2-adamantyl）guanidine），IPAG）［10］抑制了PD-L1糖基化后，PD-L1與PD-1的結合能力明顯下降。同樣，影響PD-L1糖基化修飾的分子也會影響其與PD-1的相互作用，如B3GNT3介導N192和N200處的糖基化就可以增強PD-L1與PD-1的結合［8］。

糖基化還會影響PD-L1檢測的準確性［12-13］。腫瘤組織PD-L1的表達水平是判斷患者能否從抗PD-1/PDL1治療中獲益的重要指標［14］?？贵w是檢測PD-L1表達水平的重要工具。大多數(shù)抗PD-L1抗體是用含有PDL1部分序列的多肽或重組蛋白作為抗原免疫動物而獲得的，而這些多肽或重組蛋白一般不具有糖基化等翻譯后修飾形式。PD-L1的糖基化修飾可能影響檢測抗體對其識別與結合。Lee等［13］報道，采用PNGase F處理A549 和BT-549 細胞后，以抗PD-L1 抗體（Abcam，ab58810）作為一抗進行免疫熒光檢測。與對照組相比，PNGase F處理組熒光強度顯著升高。對A549和H1299細胞進行去糖基化處理后［13］，測定抗PD-L1抗體（28-8 mAb，該抗體已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于臨床檢測）與細胞表面PD-L1的親和力。在上述2種細胞中，去糖基化處理使親和力分別增加25和55倍。上述研究結果提示，對腫瘤標本進行去糖基化處理可以重新界定PD-L1表達水平的判別標準。研究者［13］對95例接受atezolizumab（抗PD-L1抗體）治療的患者的樣本進行PD-L1表達水平檢測。未經(jīng)去糖基化處理時，PDL1高表達患者較PD-L1低表達患者的死亡風險降低18%，但2組患者的無進展生存期無顯著性差異。經(jīng)去糖基化處理后，PD-L1高表達患者的無進展生存期較PDL1低表達患者顯著延長，死亡風險降低42%。這提示去糖基化處理可提高PD-L1作為標志物預測抗PD-1/PD-L1治療療效的準確性。

2 PD-L1的泛素化

泛素化是指泛素在一系列酶的催化作用下共價結合到靶蛋白的過程。泛素是一種由76個氨基酸組成的高度保守的多肽，其C端的谷氨酸通過酰胺鍵與靶蛋白賴氨酸的ε氨基結合。當靶蛋白結合單個泛素分子時稱為單泛素化，當靶蛋白的多個賴氨酸同時被單個泛素分子標記稱為多泛素化。泛素分子本身也含有7個賴氨酸（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63），這些賴氨酸能耦連其他泛素分子形成特異的多聚泛素鏈，靶蛋白的單個賴氨酸被多個泛素分子標記稱為多聚泛素化。

2.1 PD-L1的多聚泛素化

靶蛋白被多聚泛素鏈標記后，會被26S蛋白酶體識別并被降解。PD-L1的多聚泛素化可以發(fā)生在不同的細胞間室。在內質網(wǎng)中，E3泛素連接酶HRD1（HMGCoA reductase degradation 1）可以誘導異常糖基化的PDL1發(fā)生多聚泛素化，從而發(fā)生內質網(wǎng)相關的蛋白質降解（ER-associated degradation，ERAD）［15］。在細胞質中，E3泛素連接酶β-TrCP（β-transducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase）誘導PD-L1多聚泛素化及降解［6］。干預GSK3β 或哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）活性可擾動β-TrCP和PD-L1之間的相互作用，從而影響PD-L1的多聚泛素化及穩(wěn)定性［6，27］。細胞膜上的PD-L1有較大一部分會被內化并進行再循環(huán)，該過程依賴于PD-L1與CMTM6（CKLF-like marvel transmembrane domain con?taining 6）的結合，敲除CMTM6后，E3泛素連接酶STUB1（STIP1 homology and U-box containing protein 1）便會誘導循環(huán)內體中的PD-L1多聚泛素化，從而經(jīng)溶酶體途徑降解［17-18］。這可以解釋為何CMTM6的高表達可作為預測PD-1/PD-L1抑制劑療效的獨立因素［19-20］。

研究者發(fā)現(xiàn)［21］，在不同的細胞周期中，PD-L1的表達水平呈規(guī)律性變化［21］。在M期和G1期早期，PD-L1表達水平顯著上調。而在G1晚期和S期，細胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinases 4，Cyclin DCDK4）磷酸化E3泛素連接酶Cullin 3的接頭蛋白SPOP（speckle type BTB/POZ protein），將SPOP從Cullin 3上解離下來，從而增強Cullin 3的穩(wěn)定性。Cullin 3誘導PDL1多聚泛素化，導致PD-L1表達水平降低。

2.2 PD-L1的單泛素化和多泛素化

單泛素化和多泛素化可以不依賴26S蛋白酶體系統(tǒng)對蛋白質的穩(wěn)定性、定位、內吞和運輸起調控作用。最近一項研究發(fā)現(xiàn)［22］，在表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）誘導下，PD-L1可以發(fā)生單泛素化和多泛素化，并伴隨著表達水平的增高。該研究［22］使用UbPred軟件預測PD-L1中的2個賴氨酸殘基（K178，K281）為潛在的泛素化位點，但其準確性仍需進一步的試驗確認。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制劑可顯著降低PD-L1的單一泛素化和多泛素化［22］。然而，亦有研究報道EGFR抑制劑可誘導PDL1的多聚泛素化［6］。EGFR抑制劑通過促進或抑制PDL1不同類型的泛素化，下調了PD-L1的表達。因此，有必要進一步研究EGFR信號通路誘導PD-L1的單泛素化、多泛素化和多聚泛素化之間是否存在串擾。

2.3 PD-L1的去泛素化酶

泛素化是動態(tài)可逆的修飾，靶蛋白上的泛素分子和多聚泛素鏈可被去泛素化酶解離。在口腔鱗癌細胞中，去泛素化酶USP9X（ubiquitin-specific proteases 9X）會使PD-L1去泛素化，從而增強PD-L1的穩(wěn)定性［23］。去泛素化酶USP22（ubiquitin-specific proteases 22）在肝癌中高表達，可與PD-L1的C末端相互作用，催化PDL1的去泛素化反應，增強PD-L1的穩(wěn)定性，且與肝癌患者的不良預后密切相關［24］。去泛素化酶CSN5（COP9 signalosome 5）也可誘導PD-L1的去泛素化反應［25-26］。炎癥信號，如TNF-α可使腫瘤細胞中NF-κB信號通路活化，進而增強CSN5表達。而姜黃素可通過抑制CSN5活性，從而降低炎癥信號誘導的PD-L1表達上調［25-26］。

3 PD-L1的磷酸化

PD-L1可發(fā)生磷酸化修飾，其磷酸化位點主要位于胞外結構域。不同激酶誘導PD-L1不同位點的磷酸化，并產(chǎn)生不同效應。白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）誘導杰納斯激酶-1（Janus kinase-1，JAK1）活化，后者在內質網(wǎng)與PD-L1結合，并誘導PD-L1的Y112位點磷酸化，從而招募內質網(wǎng)相關N-糖基轉移酶STT3A使PD-L1糖基化，增強PD-L1穩(wěn)定性［27］。二甲雙胍激活腺苷酸活化蛋白質激酶（adenosine-5'-monophosphate-activated protein kinase，AMPK），后者與PD-L1在內質網(wǎng)腔直接結合，使PD-L1在S195位點磷酸化，導致PD-L1的異常糖基化及內質網(wǎng)相關降解［15］。該過程通過降低PD-L1的穩(wěn)定性和膜定位，抑制了腫瘤細胞的免疫逃逸。PDL1的T180和S184位點存在能夠被GSK3β磷酸化的基序［6］。GSK3β誘導未糖基化的PD-L1磷酸化，促進PDL1與E3連接酶β-TrCP結合，導致PD-L1在細胞質中發(fā)生多聚泛素化而被降解。而N192、N200和N219位點的糖基化會造成了空間位阻，抑制GSK3β對PD-L1的磷酸化［6］。這表明β-TrCP介導的PD-L1降解是依賴GSK3β對PD-L1的磷酸化。有研究提出不依賴GSK3β的PD-L1降解途徑，即mTORC1/p70S6K誘導PD-L1的磷酸化，從而引起β-TrCP介導的PD-L1降解［16］。該模型還有待后續(xù)研究加以證實。

4 PD-L1的棕櫚?；?/h2>

棕櫚酰化修飾是指將脂肪?；ㄟ^硫酯鍵連接到靶蛋白的半胱氨酸上，這一過程由棕櫚酰轉移酶催化。據(jù)估算，約1 000種人源蛋白分子會發(fā)生棕櫚?；?8］。棕櫚?；梢杂绊懙鞍踪|分子的穩(wěn)定性、定位、運輸和相互作用等。

PD-L1能夠發(fā)生棕櫚?；揎棧?9-30］。在不同類型的腫瘤中，介導PD-L1棕櫚酰化修飾的棕櫚酰轉移酶可能不同。Yang等［30］報道，在乳腺癌中棕櫚酰轉移酶DHHC9（aspartate-histidine-histidine-cysteine 9）介導了PD-L1的棕櫚酰化修飾。而Yao等［29］在小鼠結腸癌模型中發(fā)現(xiàn)棕櫚酰轉移酶DHHC3（aspartate-histidinehistidine-cysteine 3）可以使PD-L1發(fā)生棕櫚酰化，從而抑制PD-L1的泛素化降解，提高PD-L1的表達水平。C272是PD-L1發(fā)生棕櫚?；揎椀奈稽c［29］。研究者根據(jù)該位點附近的氨基酸序列特征設計競爭性多肽。該多肽可競爭性抑制PD-L1棕櫚?；档湍[瘤細胞PDL1的表達水平并增強T細胞介導的抗腫瘤免疫反應。

5 PD-L1的乙酰化

乙?；峭ㄟ^賴氨酸乙酰化酶（lysine acetyl?transferases，KATs）將乙?；鶑囊阴］o酶A轉移到賴氨酸的ε-氨基側鏈，這個過程可以被賴氨酸去乙?；福╨ysine deacetylases，KDACs）逆轉。50多年前，賴氨酸殘基的ε氨基上的乙?；鳛榻M蛋白的翻譯后修飾首次被發(fā)現(xiàn)，其在表觀調控過程中至關重要。然而，乙?；揎椀墓δ懿⒉幌拗朴诩毎藘龋谶^去的30年里，乙?；揎椀难芯恳呀?jīng)從組蛋白擴展其他蛋白分子上。

近期一項研究報道［31］，乙?；D移酶p300可以使PD-L1胞內域K263處發(fā)生乙?；揎?，而去乙酰化酶HDAC2（histone deacetylases 2）可以使PD-L1去乙?；?。HDAC2使細胞膜上的PD-L1去乙?；螅瑑韧探宇^蛋白亨廷頓蛋白相互作用蛋白1 相關蛋白（Huntingtin interacting protein 1-related，HIP1R）與PD-L1的C端特異性結合后，網(wǎng)格蛋白依賴性內吞接頭蛋白復合體（AP-2）的β亞基（AP2B1）通過一個雙亮氨酸基序D/E-x-xx-x-L-L/I識別HIP1R，并與PD-L1結合，形成復合體，在網(wǎng)格蛋白的介導下實現(xiàn)內吞，并在波形蛋白vimentin和內輸?shù)鞍譱mportin-α的作用下，實現(xiàn)核轉位，而PDL1的乙?；瘯钄嗥浜宿D位。在癌細胞中敲除PD-L1，會在轉錄水平抑制一系列免疫相關基因的表達水平，如IFNs、NF-κB、MHCI通路相關基因。這提示，PD-L1可能入核發(fā)揮轉錄因子功能，與DNA元件結合并調控靶基因轉錄。靶向PD-L1的乙?；揎椡緩娇勺钄郟DL1的核轉位，這可為腫瘤免疫治療提供新思路［31］。但是，去乙?；磻欠袷荘D-L1發(fā)生核轉位的必要條件，還有待進一步深入研究［32-33］。

6 結語與展望

PD-L1的翻譯后修飾仍有很多值得探究的空間（圖1），未來將有更多的翻譯后修飾類型及其生物學意義被揭示。例如，有研究發(fā)現(xiàn)［22］，腫瘤細胞在EGF刺激下，其PD-L1會發(fā)生單偶氮化。探索這些新型翻譯后修飾會加深我們對PD-L1生物學功能的理解。同時，進一步研究各種PD-L1翻譯后修飾類型之間的相互串擾也具有重要價值。

通過靶向PD-L1的翻譯后修飾，降低或升高PD-L1的表達水平都可能成為腫瘤免疫治療的新型候選策略，具有良好的臨床轉化前景。部分藥物通過影響PD-L1翻譯后修飾可抑制PD-L1表達，從而活化抗腫瘤免疫反應，如依托泊苷［7］和IPAG［10］等。而另外一些藥物本身具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，卻能增加PD-L1的穩(wěn)定性，提高PD-L1的表達水平，如CDK4/6抑制劑帕博西林（palbociclib）［21］。上述藥物與PD-L1或PD-1抑制劑聯(lián)合使用具有協(xié)同抑瘤效應。目前，有多項臨床試驗在進行中（編號：NCT04438824、NCT03294694、NCT04000529、NCT04213404、NCT04251169）。

目前，多數(shù)PD-L1翻譯后修飾研究是以腫瘤細胞為模型。除腫瘤細胞外，PD-L1還表達于多種免疫細胞，如巨噬細胞［34］和T細胞［35］等。探索PD-L1在上述非腫瘤細胞中的翻譯后修飾形式及其生物學意義可能會給腫瘤免疫治療研究提供新的重要線索。深入研究PDL1的翻譯后修飾可能為腫瘤免疫治療的臨床應用提供更好策略。