靳紀洋,刁雨菲,于成明,熊雄,趙濤,何邦令,劉會香

蘋果黑腐皮殼菌侵染蘋果枝干過程的轉(zhuǎn)錄組分析

靳紀洋1,刁雨菲1,于成明1,熊雄1,趙濤2,何邦令1,劉會香1

1. 山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/山東省林業(yè)有害生物防控工程技術(shù)研究中心, 山東 泰安 271018 2. 徂徠山林場, 山東 泰安 271027

蘋果黑腐皮殼菌（var.）引起的蘋果樹腐爛病是我國蘋果產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴重的病害之一，了解病原菌侵染寄主不同時期的基因表達有助于揭示病菌的致病機制和蘋果抗病機制。本實驗應用Illumina平臺對蘋果黑腐皮殼菌侵染不同時期的寄主枝干發(fā)病過程進行轉(zhuǎn)錄組測序，同時通過與未侵染的病原菌和寄主組織進行比較。在病原菌侵染過程中，病原菌中發(fā)現(xiàn)4092個差異表達基因，寄主中發(fā)現(xiàn)16966個差異基因，通過對三個時期的上調(diào)差異表達基因進行GO和KEGG分析，結(jié)果表明病原菌侵染導致了寄主細胞壁降解、毒素物質(zhì)合成、寄主抗毒物質(zhì)分解和自身營養(yǎng)調(diào)節(jié)等過程；寄主主要通過膜脂過氧化作用、活性氧清除酶和防御酶抵抗病原菌的入侵。上述研究明確了蘋果黑腐皮殼菌與寄主互作的生物學過程，為探討病菌與寄主的分子互作機制奠定基礎(chǔ)。

蘋果腐爛病; 蘋果黑腐皮殼菌; 侵染過程; 轉(zhuǎn)錄組分析

由蘋果黑腐皮殼菌（）引起的蘋果腐爛病（canker of apple）是危害我國蘋果的重要病害。分布廣泛，危害嚴重，幾乎所有蘋果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[1]。蘋果腐爛病主要侵害蘋果的枝干和果實，導致蘋果樹皮腐爛，果實產(chǎn)量和品質(zhì)嚴重下降[1,2]。因此，深入研究病菌的的致病機制和寄主植物的抗病機制可為病害的科學防控提供理論依據(jù)。

轉(zhuǎn)錄組學是從RNA水平研究基因表達的情況，可研究病菌不同侵染階段與寄主互作基因瞬時表達情況。柯希望2014年通過Illumina RNA-Seq技術(shù)對在PDA上生長和感染蘋果枝干的蘋果黑腐皮殼菌進行轉(zhuǎn)錄組測序，通過GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)病原菌的侵染期間與果膠酶分解代謝、水解酶活性和次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因表達普遍上調(diào)[3]。并在寄主與病原菌互作數(shù)據(jù)庫注釋了一些與致病性喪失和致病力降低相關(guān)的上調(diào)基因，這些可能也參與細胞壁水解和次級代謝產(chǎn)物運輸，明確了蘋果黑腐皮殼菌侵染寄主期間次級代謝產(chǎn)物和細胞壁水解酶的重要性。本研究以蘋果黑腐皮殼菌在PDA培養(yǎng)基3 d、6 d、12 d生長的病菌和及蘋果枝干部寄主材料為對照，以上述侵染階段發(fā)病部位組織為試驗材料進行轉(zhuǎn)錄組分析以期解析病原菌與寄主互作的代謝途徑及生物學過程，為探討病菌與寄主植物的分子互作機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的培養(yǎng)和人工接種

病菌為蘋果黑腐皮殼菌（）強致病力菌株sdau11-175，采集自山東煙臺，本實驗室分離，20%甘油，4 ℃保存待用。

病原菌接種：選取自山東農(nóng)業(yè)大學植保實驗站直徑1~2 cm兩年生生長一致的富士蘋果枝條。將枝條切成25 cm長的段，用自來水沖洗，后浸泡在1%次氯酸鈉中10 min，再用無菌水沖洗3次，頂端封蠟，每個枝條用打孔器打取間隔5 cm直徑5 mm傷口[3]。然后將PDA培養(yǎng)6 d相同直徑的病菌菌餅接種于上述傷口中，脫脂棉保鮮膜保濕度，25 ℃水培，于第3 d、第6 d、第12 d分別收集0.2 g PDA病菌菌絲體、空白培養(yǎng)基接種蘋果組織和病斑組織置于1.5 mL無菌離心管中，液氮冷凍﹣80 ℃保存、每一個時段樣本重復3次。

1.2 RNA的提取和測序

按照試劑盒（miRNA ISOlation Kit，Ambion-1561，mirVana?公司）說明提取各樣品的RNA，并使用DNase消化DNA后，用帶有OligodT的磁珠富集真核生物mRNA，以打斷后的mRNA為模板合成二鏈cDNA，將純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后進行片段大小選擇，最后加入PCR Primer Cocktail和PCR Master Mix混勻，進行PCR擴增，純化后得到文庫，用Agilent 2100 Bioanalyzer[4]質(zhì)檢合格后，Illumina HiSeqTM 2500進行測序，產(chǎn)生125 bp或150 bp的雙端數(shù)據(jù)。

1.3 原始數(shù)據(jù)的過濾、比對和序列注釋

對通過Illumina平臺所獲得的大量雙端測序數(shù)據(jù)，采用Trimmomatic[5]軟件對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量預處理，并對整個質(zhì)控過程中的reads數(shù)進行統(tǒng)計匯總，去除接頭（Adaptor）和低質(zhì)量Reads得到Clean Reads。利用hisat2[6]將Clean Reads與指定的參考基因組進行序列比對，獲取在參考基因組或基因上的位置信息，以及測序樣品特有的序列特征信息。用已知的參考基因序列以及注釋文件的數(shù)據(jù)庫為依據(jù)，采取序列相似性比對的方法鑒定出各蛋白編碼基因在各樣本中的表達豐度，使用htseq-count[7]軟件獲取每個樣本中比對到蛋白編碼基因上的reads數(shù)，利用cufflinks[8]軟件來計算蛋白編碼基因的表達量FPKM值。

1.4 差異表達基因篩選

利用DESeq[9]軟件對各個樣本基因的counts數(shù)目進行標準化處理（采用basemean值來估算表達量），計算差異倍數(shù)，并采用NB（負二項分布檢驗的方式）對reads數(shù)進行差異顯著性檢驗[10]，最終根據(jù)差異倍數(shù)及差異顯著性檢驗結(jié)果來篩選差異蛋白編碼基因（默認篩選差異的條件為<0.05且差異倍數(shù)大于2）。

1.5 差異表達基因GO和KEGG富集分析

得到差異表達基因之后，對上調(diào)的差異表達基因進行GO富集分析，結(jié)合GO注釋結(jié)果對其功能進行描述和分類。利用KEGG[11]數(shù)據(jù)庫對差異蛋白編碼基因進行Pathway分析，找到富集差異基因的Pathway條目，尋找不同樣品的差異蛋白編碼基因所參與的代謝過程和細胞信號通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)產(chǎn)出與統(tǒng)計

通過對蘋果樹腐爛病侵染蘋果枝干過程中的27個樣品的有參轉(zhuǎn)錄測序，其中蘋果樹腐爛病獲得62.18G的Clean Data，各樣本的有效數(shù)據(jù)量分布在6.84~6.95G，Q30堿基分布在92.96~94.00%，平均GC含量為54.83%。通過將reads比對到蘋果黑腐皮殼菌（）參考基因組上，得到各個樣本的基因組比對情況，比對率為89.52~97.19%；寄主蘋果枝干獲得124.03G的Clean Data，各樣本的有效數(shù)據(jù)量分布在6.76~7.00G，Q30堿基分布在94.71~95.57%，平均GC含量為49.43%。通過將reads比對到蘋果（）參考基因組上，得到各個樣本的基因組比對情況，比對率為8.31~94.42%（見表1）。

表 1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.2 差異表達基因篩選

將過濾后的數(shù)據(jù)進行比對發(fā)現(xiàn)侵染后的病原菌與寄主都具有較高的蛋白編碼基因豐富度。根據(jù)篩選標準（<0.05&| FoldChange |>2）從病原菌中找到差異表達基因4092個，其中上調(diào)基因含2363個，在三個時期（3 d、6 d、12 d）分別有294、721、1348個上調(diào)基因，而在寄主中找到16966個差異表達基因，在三個時期分別有2073、2063、3121個上調(diào)基因，下調(diào)基因分別有1203、2700、5806個（見圖1）。

圖 1 病原菌和寄主不同時期差異表達基因

2.3 黑腐皮殼菌侵染蘋果不同時期差異表達基因GO和KEGG富集分析

GO term用于整個轉(zhuǎn)錄組的功能分類，基于序列同源性將上調(diào)差異表達基因分成三個最基本類別：生物過程（biological process）、細胞成分（cellular component）、分子功能（molecular function）。病原菌侵染第3 d時，主要富集的生物過程有次級代謝產(chǎn)物合成、糖異生和碳水化合物代謝，水解酶類活性增強，KEGG表明碳代謝、丙酮酸代謝和甘油脂代謝得到了富集；侵染第6 d時，多糖代謝分解過程、果膠分解代謝過程為主要的生物過程，KEGG富集的代謝途徑有：果糖和甘露醇代謝、芳香族化合物的降解和藥物代謝（細胞色素P450）；侵染第12 d時，GO term富集了視黃醇代謝過程、纖維素和果膠分解代謝過程和色素生物合成過程，KEGG富集的信號途徑有抗壞血酸和醛酸代謝、苯丙酸生物合成和水楊酸代謝（見表2和表3）。

表 2 蘋果黑腐皮殼菌侵染蘋果不同時期的GO富集分類

aGO分類類別，“P”代表“生物過程”；“F”代表“分子功能”，b該GO條目中上調(diào)的差異基因數(shù)

aGO classification category, "P" stands for "biological process"; "F" stands for "molecular function";bthe number of differential genes up-regulated in GO term.

表 3 蘋果黑腐皮殼菌侵染蘋果不同時期KEGG富集分類

a該KEGG條目中上調(diào)的差異基因數(shù)。

aThe number of differential genes up-regulated in KEGG.

2.4 蘋果枝干受病菌侵染不同時期差異表達基因GO和KEGG富集分析

被侵染期間蘋果枝干組織與細胞壁修復和抗菌物質(zhì)分泌的基因上調(diào)表達。侵染第3 d時，主要富集的生物過程有成纖維細胞化過程、調(diào)節(jié)對營養(yǎng)水平的反應、調(diào)節(jié)DNA模板轉(zhuǎn)錄對應激的反應和木質(zhì)素生物合成過程，KEGG表明次級代謝產(chǎn)物合成、植物病原相互作用和植物激素信號傳導等途徑富集；侵染第6 d時，GO富集到了酚類化合物合成、對幾丁質(zhì)的反應和木質(zhì)素生物合成過程；KEGG表明谷胱甘肽代謝、煙酸代謝、脂肪酸代謝以及MAPK信號通路富集；侵染第12 d時，GO表明半胱氨酸氧化、水楊酸分解代謝過程和細胞色素氧化酶富集，KEGG表明維生素B6代謝途徑、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化和氨基酸代謝途徑富集（見表4和表5）。

表 4 蘋果枝干受病菌侵染不同時期GO富集分類

aGO分類類別，“P”代表“生物過程”；“F”代表“分子功能”；b該GO條目中上調(diào)的差異基因數(shù)。

aGO classification category, "P" stands for "biological process"; "F" stands for "molecular function";bthe number of differential genes up-regulated in GO term.

2.5 蘋果黑腐皮殼菌與蘋果互作機制分析

從上述表2~3可以看出，蘋果黑腐皮殼菌接觸蘋果枝干時，與寄主互作和信號傳導的代謝過程主要產(chǎn)生了植物細胞壁降解酶、有毒物質(zhì)、生長調(diào)節(jié)劑等次級代謝產(chǎn)物。病原菌產(chǎn)生的果膠酶將寄主細胞膠層中的果膠多糖降解，纖維素酶對細胞壁中的纖維素有軟化和分解作用，β-半乳糖甘酶促進細胞壁中乳糖降解成半乳糖和葡萄糖，加速細胞壁松弛，生成的葡萄糖通過代謝與轉(zhuǎn)化為病原菌生理活動提供營養(yǎng)。毒素是病原菌主要的致病因子，大多數(shù)毒素作用于寄主葉綠體、質(zhì)膜、線粒體和細胞膜外，使細胞膜透性改變，針對寄主植物產(chǎn)生的抗毒素物質(zhì)，病原菌通過藥物代謝外援物質(zhì)、調(diào)整自身生理活動來應對。

表 5 蘋果枝干受侵染不同時期KEGG富集分類

a該KEGG條目中上調(diào)的差異基因數(shù)。

aThe number of differential genes up-regulated in KEGG.

從上述表4~5可以看出，受到侵染后的蘋果枝干的防御體系主要依靠防御酶的活性催化活動完成。過氧化物酶（POD）參與了木質(zhì)素前體生物合成，加速自身傷口愈合和抑制病原菌水解酶的活性；苯丙氨酸解氨酶（PAL）參與催化酚類物質(zhì)、類黃酮、木質(zhì)素等次級代謝產(chǎn)物合成；多酚氧化酶（PPO）將酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成醌類化合物起到解毒作用，阻礙病原菌進一步侵入；活性氧清除系統(tǒng)減少氧自由基和過氧化物的迫害作用，如過氧化物歧化酶（SOD）清除寄主體內(nèi)的O2·-，產(chǎn)生大量過氧化氫（H2O2），最后被過氧化氫酶（CAT）分解。最后谷胱甘肽作為細胞內(nèi)重要的調(diào)節(jié)代謝物質(zhì)，含量降低，產(chǎn)生的氧自由基促使細胞發(fā)生凋亡。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本研究通過對不同侵染階段的蘋果黑腐皮殼菌與蘋果枝干進行轉(zhuǎn)錄組測序，通過測序得到了186.21G的數(shù)據(jù)，GC含量均衡，Q30正確識別率高，與參考基因組比對率高，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量高。

蘋果黑腐皮殼菌在侵染過程中的生理功能主要表現(xiàn)為四個方面：降解寄主植物細胞壁、合成毒素物質(zhì)、分解寄主抗病物質(zhì)和調(diào)節(jié)營養(yǎng)水平。降解細胞壁的酶主要有果膠酶、纖維素酶、半纖維素和蛋白酶等。與果膠水解相關(guān)的基因在侵染的三個時期有很大差別。毒素作為病原菌產(chǎn)生的對寄主組織具有損傷破壞性的次級代謝產(chǎn)物，作用于寄主植物體內(nèi)的不同位點，它的產(chǎn)生依靠丙酮酸代謝、脂肪酸代謝和芳香化合物合成等多種代謝途徑，同時細胞色素酶P450代謝寄主植物分泌的抗菌物質(zhì)。

蘋果體內(nèi)的氧自由基反應和脂質(zhì)過氧化反應在病原菌侵染過程中膜脂發(fā)生過氧化，在寄主體內(nèi)的氧自由基在脂氧合酶（LOX）的催化作用下生成的丙二醛（MDA）具有細胞毒性。病原菌的入侵誘導寄主體幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶的積累，抑制病原菌的生長。寄主受到病原菌侵染后，單酚類、類黃酮類、過氧化物酶、香豆素類物質(zhì)迅速合成，抑制病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長，香豆素是木質(zhì)素的合成前體，過氧化物酶通過催化合成殺菌物質(zhì)，提高合成木質(zhì)素，從而形成蘋果的抗病性。

3.2 討論

本研究通過轉(zhuǎn)錄組初步分析了蘋果黑腐皮殼菌與蘋果枝干互作機制，與柯希望的結(jié)果相比各有異同，雖然發(fā)現(xiàn)了果膠酶、纖維素酶對寄主的細胞壁的降解作用，但是酶的種類與數(shù)量卻有所差異。在柯希望的研究中用于轉(zhuǎn)錄組分析的組織為感染5 d后的蘋果樹枝，而本研究中選取了3、6、12 d 3個侵染時期的寄主為材料，包含整個侵染過程，對每個時期的代謝通路進行分析得到了病原菌中致病的轉(zhuǎn)錄因子，同時對被侵染的寄主進行轉(zhuǎn)錄組測序，本研究通過上述轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)了大量的差異表達基因，但這些基因所參與的代謝通路及其與其它相關(guān)基因的分子互作機制還需要深入解析，下一步將繼續(xù)通過酵母雙雜文庫構(gòu)建及其篩選等方法，解析病菌與寄主的分子互作機制，為蘋果分子抗病育種尋找新的途徑提供依據(jù)。

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Transcriptome Analysis during Apple Stem Infected by

JIN Ji-yang1, DIAO Yu-fei1, YU Cheng-ming1, XIONG Xiong1, ZHAO Tao2, HE Bang-ling1*, LIU Hui-xiang1*

1.271018,2.271027,

s:Apple Valsa canker caused byis one of the most serious diseases in apple producing areas in China. Understanding the gene expression of pathogen infected host at different periods is helpful to find out pathogenic mechanism of the pathogen infection and resisting mechanism of host plant. This paper mainly using Illumina platform to sequence the transcriptome of pathogen and host during infection of, and compare with the uninfected pathogen and host, 4092 differential expressed genes from pathogen and 16966 differential expressed genes from host were obtained. Go and KEGG analysis of the up-regulated differential expressed genes in the three periods were carried out respectively. The results showed that degradation of host cell wall, synthesis of toxin, decomposition of anti toxin and self nutrition regulation during the pathogen infection process, and the host mainly resisted the invasion of pathogen through membrane lipid peroxidation, active oxygen scavenging enzyme and defense enzyme. All results above explained the biological process of interaction between theand host, and provided a basis for probing molecular interaction mechanism between pathogen and apple.

Apple valsa canker disease;; infection process; transcriptome analysis

S436.629

A

1000-2324(2021)02-0187-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.02.005

2020-02-12

2020-05-04

山東省自然基金項目(ZR2017MC042);國家自然基金項目(31770684)

靳紀洋(1995-),男,碩士研究生,主要從事林果病原與寄主互作機制研究. E-mail:869270039@qq.com

Author for correspondence. E-mail:hebangling@126.com; hxliu722@126.com