李 麗，彭 舒，宋情來，簡 青，嚴(yán)紅光

（凱里學(xué)院，貴州 凱里 556011）

金秋梨是從新高梨芽變株系中選育出的砂梨品種[1]，有“南方梨王”的美稱，主要分布在我國湖南、貴州等地。金秋梨果實外表皮呈紅褐色，光滑有光澤，果肉為白色且果實含水量極高，味道香甜，具有很高的營養(yǎng)價值[2]。有研究表明，常溫下貯藏20 d后的完熟金秋梨會出現(xiàn)呼吸高峰，第2次呼吸高峰在貯藏50 d后出現(xiàn)，金秋梨于貯藏60 d后基本失去商品價值[3]。研究發(fā)現(xiàn)，大量的病害發(fā)生在金秋梨的貯藏期間，導(dǎo)致果實外觀品質(zhì)及貨架期受到嚴(yán)重影響，其中輪紋病是發(fā)病率較高的一種病害[4]。梨輪紋病主要是由葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）引起的真菌性病害，多發(fā)生于枝條和果實上，在多雨年份或貯藏期間發(fā)生，可導(dǎo)致爛果率超過80%[5]。

絕大多數(shù)果農(nóng)對金秋梨的栽培管理技術(shù)不當(dāng)，多采用化學(xué)藥劑防治病害，而藥劑一般會使金秋梨產(chǎn)生抗藥性，且果實會有藥劑殘留[6]。茉莉酸甲酯（MeJA）是一類新型的植物激素，可提高果蔬抗性，延長果蔬貯藏時間，且對人體無毒害，對環(huán)境無污染。近年來，MeJA在香蕉[7]、葡萄[8]、杧果[9]、藍(lán)莓[10]、蘋果[11]、梨[12-13]等果品上的研究有顯著效果，但多采用采后處理的方法，而且在金秋梨上未見報道。本文研究采前MeJA噴施處理對采后金秋梨抗病性和貯藏品質(zhì)的影響，以期為提高采后金秋梨果實的抗病性和貯藏品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

供試金秋梨來自貴州省臺江縣臺盤鎮(zhèn)四步橋金秋梨種植地，選取負(fù)載量和樹勢一致的植株進(jìn)行試驗。采收時選擇外觀均勻一致、成熟度和大小一致、無機(jī)械傷和病蟲害的金秋梨進(jìn)行試驗。

茉莉酸甲酯，購于西亞化學(xué)科技（山東）有限公司，純度為95%；梨輪紋病病原菌葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea），購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。幾丁質(zhì)、脫鹽蝸牛酶、N-乙酰葡萄糖胺、昆布多糖、3,5-二硝基水楊酸、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性檢測試劑盒、愈創(chuàng)木酚、巴比妥酸、2,6-二氯靛酚鈉鹽、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品，購于北京索萊寶科技有限公司；鄰苯二酚、三氯乙酸、過氧化氫、Tween 80、Folin-酚試劑，購于西亞化學(xué)科技（山東）有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FL-R02-20超凈工作臺，PRX-380A智能人工氣候箱，DW-HL388超低溫冷凍儲存箱，5430R臺式高速冷凍離心機(jī)，TU-1900雙光束紫外可見分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 MeJA采前噴施處理方案

分別在金秋梨采收前10 d、20 d和30 d使用10 mmol/L的茉莉酸甲酯（含0.05%Tween 80）溶液均勻噴施金秋梨果實果面，共噴施3次；同時以含0.05%Tween 80的蒸餾水處理的金秋梨果實為對照組。果實成熟采收后運至凱里學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工貯藏實驗室備用。

1.2.2 果實的刺傷接種

參照鄧惠文等[14]的方法，略有改動。先使用75%酒精對金秋梨果實表面進(jìn)行消毒，待果面酒精干后將金秋梨移入超凈工作臺，在超凈工作臺上對金秋梨果實進(jìn)行損傷接種，用滅菌后的接種針在果實表面中部選取一個點插孔（深3 mm，直徑3 mm），將10μL濃度為1×105個/mL的梨輪紋病病原菌葡萄座腔菌孢子懸浮液注入刺傷的孔內(nèi)。接種處理后，采用透明PE保鮮袋（規(guī)格為50 cm×70 cm，17 g/只）裝袋，每袋18個果實，每個處理3袋，于常溫（25±2）℃條件下貯藏，定期進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.2.3 測定項目與方法

1.2.3.1 病斑直徑及發(fā)病率

病斑直徑：采用十字交叉法測量病斑，利用游標(biāo)卡尺測量病斑直徑，取每個處理發(fā)病傷口的病斑直徑平均值。

發(fā)病率：觀察接種處發(fā)病情況，病斑直徑擴(kuò)展至0.5 mm則認(rèn)為發(fā)病。

1.2.3.2 抗病性相關(guān)酶活性

將經(jīng)過接種處理的梨果實去皮，取果肉切塊混勻，立即用液氮速凍后放入-80℃冰箱待測。從接種后當(dāng)天取樣，以后每4 d取一次樣。

幾丁質(zhì)酶（CHI）和β-1，3-葡聚糖酶（GLU）活性：參照曹建康等[15]的方法測定，CHI活性以每秒生成1μmol N-乙酰葡萄糖胺為1個活性單位（U），GLU活性以每秒生成1 mg葡萄糖為1個活性單位（U）。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性：采用試劑盒測定。

過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性：參照石亞莉等[16]的方法測定，POD活性以每分鐘OD470增加0.01為1個活性單位（U），PPO活性以每分鐘OD398增加0.01為1個活性單位（U）。

過氧化氫酶（CAT）活性：參照李磊[17]的方法測定，以每分鐘OD240減少0.01為1個活性單位（U）。

1.2.3.3 丙二醛（MDA）含量和總酚含量

MDA含量：參照曹建康等[15]的方法測定，略有改動。取1.0 g果肉樣品和5.0 mL 100 g/L三氯乙酸（TCA），冰浴研磨，然后在4℃、12 000 r/min條件下離心20 min，取2.0 mL上清液，再加入2.0 mL體積分?jǐn)?shù)為0.67%硫代巴比妥酸（TBA）混勻，沸水浴中煮沸30 min，取出并迅速冷卻，再在4℃、10 000 r/min條件下離心10 min。分別測定450 nm、532 nm和600 nm處的吸光度值，計算MDA含量。

總酚含量：參照王璇[18]的方法，采用Folin-酚法測定。測定總酚提取液與Folin-酚試劑混合液在765 nm處的吸光度值，根據(jù)以沒食子酸為底物制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總酚含量。

1.2.3.4 品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)

VC含量：參照黃曉杰[19]的方法，采用2,6-二氯靛酚滴定法測定。

失重率：每個處理隨機(jī)取18個果實放入保鮮袋，重復(fù)3次，貯藏過程中稱量每袋果實的質(zhì)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及處理，采用Origin Pro 8進(jìn)行繪圖及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 采前MeJA處理對接種梨輪紋病病原菌金秋梨果實發(fā)病情況的影響

將采收后接種梨輪紋病病原菌葡萄座腔菌的金秋梨于常溫（25±2）℃條件下貯藏，觀察其發(fā)病率及病斑直徑。由圖1可以看出，常溫貯藏觀察發(fā)現(xiàn)金秋梨果實于第4天開始發(fā)病，且整個貯藏期間，采前MeJA處理能顯著降低金秋梨輪紋病的發(fā)病率（P＜0.05）；與對照相比，貯藏第4、8、12、16天的發(fā)病率分別降低了26.7、16.7、26.7、10.0個百分點。

由圖2可以看出，在常溫貯藏過程中，采前MeJA處理的果實病斑直徑均小于對照，且在貯藏16 d和20 d時均顯著低于對照（P＜0.05），病斑直徑分別降低了11.3 mm和17.7 mm。

圖1 采前MeJA處理對刺傷接種B.dothidea后金秋梨果實發(fā)病率的影響Fig.1 Effects of pre-harvest MeJA treatment on incidence rates of‘Jinqiu’pear fruits inoculated with B.dothidea

圖2 采前MeJA處理對刺傷接種B.dothidea后金秋梨果實病斑直徑的影響Fig.2 Effects of pre-harvest MeJA treatment on lesion diameters in‘Jinqiu’pear fruits inoculated with B.dothidea

2.2 采前MeJA處理對接種梨輪紋病病原菌金秋梨果實抗病性相關(guān)酶活性的影響

CHI和GLU可以降解細(xì)胞壁的成分，抑制病原菌的生長。由圖3可以看出，整個貯藏期間，采前MeJA處理組果實CHI活性顯著高于對照組（P＜0.05）。CHI活性在貯藏期間呈先上升后下降的趨勢。貯藏第8天時，CHI活性達(dá)到峰值，采前MeJA處理組是對照組果實的1.38倍。

圖3 采前MeJA處理對刺傷接種B.dothidea后金秋梨果實CHI活性的影響Fig.3 Effects of pre-harvest MeJA treatment on CHI activities in‘Jinqiu’pear fruits inoculated with B.dothidea

由圖4可以看出，采前MeJA處理的金秋梨果實GLU活性在貯藏期間呈上升的趨勢，且顯著高于對照組（P＜0.05），貯藏20 d達(dá)到峰值，是同期對照組的1.26倍。

圖4 采前MeJA處理對刺傷接種B.dothidea后金秋梨果實GLU活性的影響Fig.4 Effects of pre-harvest MeJA treatment on GLU activities in‘Jinqiu’pear fruits inoculated with B.dothidea

PAL、POD、PPO可以促進(jìn)抗菌物質(zhì)的生成。由圖5可以看出，MeJA采前處理果實的PAL活性顯著高于對照組（P＜0.05）。貯藏第8天時，采前MeJA處理組與對照組果實的PAL活性出現(xiàn)第1個小高峰，第16天時采前MeJA處理出現(xiàn)第2個明顯的高峰，是同期對照組的1.51倍，而對照組并未出現(xiàn)第2個高峰。

圖5 采前MeJA處理對刺傷接種B.dothidea后金秋梨果實PAL活性的影響Fig.5 Effects of pre-harvest MeJA treatment on PAL activities in‘Jinqiu’pear fruits inoculated with B.dothidea

由圖6可以看出，采前MeJA處理果實的POD活性顯著高于對照組（P＜0.05）。貯藏0～12 d，采前MeJA處理組和對照組果實POD活性呈緩慢上升的趨勢；貯藏12～20 d，采前MeJA處理組果實POD活性呈現(xiàn)先快速上升后趨于平穩(wěn)的趨勢，對照組則呈先迅速上升再下降的趨勢。

由7可以看出，采前MeJA處理的果實PPO活性顯著高于對照組（P＜0.05）。PPO活性在貯藏期間呈先上升后下降的趨勢。貯藏第12天時，果實的PPO活性達(dá)到峰值，采前MeJA處理是對照的1.18倍。

圖6 采前MeJA處理對刺傷接種B.dothidea后金秋梨果實POD活性的影響Fig.6 Effects of pre-harvest MeJA treatment on POD activities in‘Jinqiu’pear fruits inoculated with B.dothidea

圖7 采前MeJA處理對刺傷接種B.dothidea后金秋梨果實PPO活性的影響Fig.7 Effects of pre-harvest MeJA treatment on PPO activities in‘Jinqiu’pear fruits inoculated with B.dothidea

CAT通過氧化過氧化氫來減少過氧化氫對植物的損傷。由圖8可以看出，采前MeJA處理的果實CAT活性顯著高于對照組（P＜0.05）。CAT活性在貯藏期間呈下降趨勢。

圖8 采前MeJA處理對刺傷接種B.dothidea后金秋梨果實CAT活性的影響Fig.8 Effects of pre-harvest MeJA treatment on CAT activities in‘Jinqiu’pear fruits inoculated with B.dothidea

2.3 采前MeJA處理對接種梨輪紋病病原菌金秋梨果實的MDA含量和總酚含量的影響

MDA是衡量膜脂過氧化的重要指標(biāo)之一。由圖9可以看出，采前MeJA處理組金秋梨果實的MDA含量顯著低于對照（P＜0.05）。整個貯藏期間，果實中MDA含量整體呈上升的趨勢，貯藏第20天時，MDA含量最高，采前MeJA處理組果實MDA含量比對照低0.30μmol/g。

圖9 采前MeJA處理對刺傷接種B.dothidea后金秋梨果實MDA含量的影響Fig.9 Effects of pre-harvest MeJA treatment on MDA contents in‘Jinqiu’pear fruits inoculated with B.dothidea

總酚是抗性相關(guān)物質(zhì)，能夠抑制病原菌的生長。由圖10可以看出，采前MeJA處理果實的總酚含量顯著高于對照（P＜0.05）。整個貯藏期間，總酚含量整體呈先上升后下降的趨勢，貯藏第8天時，總酚含量最高，采前MeJA處理組果實總酚比對照高0.85 mg/g。

圖10 采前MeJA處理對刺傷接種B.dothidea后金秋梨果實總酚含量的影響Fig.10 Effects of pre-harvest MeJA treatment on total phenols contents in‘Jinqiu’pear fruits inoculated with B.dothidea

2.4 采前MeJA處理對未接種病原菌孢子的金秋梨VC含量和失重率的影響

由圖11可以看出，采前MeJA處理果實的VC含量顯著高于對照（P＜0.05）。整個貯藏期間，果實的VC含量整體呈下降的趨勢。貯藏0～8 d果實VC含量下降較快；8 d以后下降緩慢；貯藏第20天時，采前MeJA處理組果實VC含量較對照高2.08 mg/100 g。

由圖12可以看出，采前MeJA處理果實的失重率低于對照。貯藏4、16、20 d時，采前MeJA處理組果實失重率顯著低于對照（P＜0.05）。由此可見，采前MeJA處理可有效抑制金秋梨果實的失重。

圖11 采前MeJA處理對金秋梨果實VC含量的影響Fig.11 Effects of pre-harvest MeJA treatment on vitamin C contents in‘Jinqiu’pear fruits

圖12 采前MeJA處理對金秋梨果實失重率的影響Fig.12 Effects of pre-harvest MeJA treatment on weightless rates in‘Jinqiu’pear fruits

3 討論與結(jié)論

果蔬受病原菌侵染后，自身會產(chǎn)生一系列防御反應(yīng)，而MeJA處理可通過提高果蔬抗病性，減少果蔬在生產(chǎn)和貯藏過程中染病腐爛。經(jīng)大量研究表明，MeJA可以有效抑制果實采后真菌性病害[7-13]，其效果因品種、處理時間和濃度而異。本研究結(jié)果表明，采前10 mmol/L MeJA處理能夠明顯抑制金秋梨輪紋病的發(fā)病率及病斑直徑的擴(kuò)大，這與王英珍等[12]研究的采前7 mmol/L MeJA處理對抑制梨黑斑病菌的結(jié)果相近。但采前處理時，浸泡處理不當(dāng)易造成果實脫落，且技術(shù)實用性不強(qiáng)，因此本試驗采用MeJA噴果處理，其抑菌性效果不及王英珍等[12]浸泡處理。

MeJA作為與損傷相關(guān)的植物激素和信號因子，能誘導(dǎo)植物進(jìn)行化學(xué)防御，從而促使果實產(chǎn)生抗病性[20]。MeJA采前或采后處理可以增強(qiáng)抗性相關(guān)酶活，以起到一定的防御作用。

CHI和GLU參與細(xì)胞壁的降解，可通過破壞病原菌的細(xì)胞壁以殺死病原菌。POD、PPO、PAL可以催化抗菌物質(zhì)的形成。作為抗菌物質(zhì)的木質(zhì)素，其在合成過程中需要POD催化過氧化氫的水解反應(yīng)；PPO能將酚類物質(zhì)氧化成毒性強(qiáng)的醌類物質(zhì)，同時參與木質(zhì)素的形成；PAL是苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶，能通過催化L-苯丙氨酸裂解脫氫反應(yīng)來合成黃酮類物質(zhì)、酚類物質(zhì)、木質(zhì)素和水楊酸等。CAT能催化過氧化氫分解，從而減少過氧化氫對果蔬組織造成的傷害。本研究結(jié)果表明：采前10 mmol/L MeJA處理能有效提高上述與抗病性相關(guān)酶的活性。這與王英珍等[12]、王璇[18]和汪開拓等[21]的研究結(jié)果一致，由于不同種類和品種果實產(chǎn)生的抗病性不同，酶活性大小會有所差異。

MDA是常用的膜脂過氧化的衡量指標(biāo)，當(dāng)果蔬中MDA含量過多時將會造成果蔬的細(xì)胞質(zhì)膜及細(xì)胞器受到一定程度的傷害。本研究結(jié)果表明：采前10 mmol/L MeJA處理對降低金秋梨果實MDA的生成具有一定的效果，通過降低MDA生成量，從而減輕果蔬在貯藏過程中受到的傷害。總酚是植物重要的次生代謝產(chǎn)物，與果蔬的色澤、品種、風(fēng)味、抗逆性和抗病性等密切相關(guān)。本試驗結(jié)果表明：采前10 mmol/L MeJA處理能夠有效增加金秋梨果實總酚含量，從而提高果實的抗病性，這與弓德強(qiáng)等[9]在杧果上的試驗結(jié)果一致。

采前10 mmol/L MeJA處理對金秋梨的抗病性有著積極的影響，且影響效果顯著。采用新型植物激素處理果實以提高果實自身的抗病能力，相比物理防治和化學(xué)藥劑防治來說具有更環(huán)保、無公害、無殘留且效果顯著等特點。今后可以在分子水平上進(jìn)一步研究MeJA的抗病機(jī)理，為探索可產(chǎn)生抗性的保鮮劑提供更多的理論支持。