解丹 宋效惠 王海峰 房衍林 張乾石 遲德富

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)(吉林省敦化市林業(yè)局)(吉林省撫松縣露水河林業(yè)局宏偉種子園)(森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué)))

紅松(Pinuskoraiensis)屬松科(Pinaceae)松屬(Pinus)[1]，是東北地區(qū)特有的果材兼用型林木[2]，其木質(zhì)通直優(yōu)良，是建筑、橋梁、家具制作的上等材料，枝丫、樹皮、樹根可用來制造紙漿和纖維板[3-4]。目前赤松梢斑螟(Dioryctriasylvestrella)主要危害紅松主干、主梢和樹冠上部的側(cè)梢，導(dǎo)致折干、折頭、折枝，影響結(jié)實量的同時材質(zhì)和出材率也大幅下降[5]。該蟲引發(fā)的樹勢衰弱還會引發(fā)其他病蟲害的發(fā)生。在東北地區(qū)赤松梢斑螟世代不整齊，在其活動季節(jié)可同時存在多個蟲態(tài)和多個蟲齡[6]。其危害一般從距地面1.5 m左右開始向上排布，被害程度逐年加重[7]。目前因其對經(jīng)濟和生態(tài)的重大影響，赤松梢斑螟已成為我國當(dāng)前重點防控對象[8]。

在植食性昆蟲與寄主化學(xué)通信系統(tǒng)中，植物釋放的特定揮發(fā)性化合物能夠調(diào)控昆蟲的多種行為[9]。近年來，利用從植物或植物產(chǎn)品中提取、分離的生物活性物質(zhì)影響害蟲行為來控制其種群數(shù)量，已經(jīng)成為害蟲綜合治理的一個趨勢[10]。王琪等[5]用GC-MS分析了健康和受害紅松球果、主梢及側(cè)枝晝夜釋放揮發(fā)物的組分及相對含量變化。賈曉軒[11]在紅松枝葉總揮發(fā)性有機化合物(TVOC)中共鑒定出11類223種有機物。孫凡等[12]采用自動頂空進樣與GC-MS聯(lián)用技術(shù)，分析了被松梢象(Pissodesnitidus)危害的紅松主梢、健康紅松主梢以及健康紅松側(cè)梢的揮發(fā)性物質(zhì)成分，共發(fā)現(xiàn)22種揮發(fā)性物質(zhì)。但是關(guān)于不同種源紅松主干揮發(fā)物的研究，至今未見報道。本研究利用動態(tài)頂空取樣法收集了相同生境下被害程度不同的異質(zhì)種源紅松健康主干的揮發(fā)物，并用GC-MS分析了揮發(fā)物的成分及其相對含量，以期探明不同種源紅松主干揮發(fā)物的差異，分析赤松梢斑螟在定位寄主中潛在利用的揮發(fā)性信息化合物，為設(shè)計引誘、驅(qū)避劑進行林間誘捕奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究林分概況

2020年8月，在撫松縣露水河鎮(zhèn)宏偉種子園同一園區(qū)內(nèi)選取5個不同種源的紅松人工林開展研究。研究的5個種源分別來自黑龍江省帶嶺林業(yè)局碧水林場(碧水種源)、寒月林場(寒月種源)，黑龍江省豐林縣林業(yè)局立林林場(立林種源)，吉林省撫松縣宏偉林場(宏偉種源)，吉林省安圖縣林業(yè)局馬鞍山林場(馬鞍山種源)。這些林分分別由同一年從不同種源地采集的紅松優(yōu)樹種子育苗的3年生容器苗以隨機排布方式造林建成。到2020年樹齡18 a，平均樹高3.20 m，平均胸徑12.80 cm。

1.2 不同種源紅松的被害情況調(diào)查

每個紅松種源隨機選擇60株樣樹。調(diào)查時繞每株樣樹一周，從樹基觀察到主梢，檢查頂梢第4輪枝以下的樹干是否受害，以及被害后流出的松脂與赤松梢斑螟蛀食過程中形成的食物殘渣及糞?；煸谝黄鹦纬傻氖澄餁堅?蟲糞-松脂凝結(jié)團(以下簡稱凝脂團)個數(shù)。記錄每株樣樹是否被害，以及凝脂團數(shù)。

1.3 揮發(fā)物的采集與分析

1.3.1 揮發(fā)物的采集

蘇瑪罐準(zhǔn)備：采樣罐為容積3.2 L、內(nèi)壁硅烷化的SiloniteTM蘇瑪罐(美國ENTECH公司)，使用前用高純氮清洗3遍后抽成真空。

繞樹干采樣桶制作：先在樹干上距地面1.0～1.5 m處，選取樹皮完好的部位，用裝有閥門的聚四氟乙烯薄膜包裹樹干，薄膜接口處用密封條封嚴(yán)，形成一個高20 cm圍繞樹干的聚四氟乙烯薄膜桶；在桶的上、下端各2～3 cm處用細(xì)鐵絲將桶緊密固定在樹干上，做成一個高15 cm的采樣桶。為確保采樣桶的密閉性，在固定之前分別在鐵絲與薄膜之間，以及薄膜與樹皮之間填充一定量的脫脂棉和膨體四氟帶。

采樣：用聚四氟乙烯軟管將大氣采樣儀(QC-1B型，北京市勞動保護科學(xué)研究所)進氣口連接到聚四氟乙烯采集桶的閥門上；先打開閥門，再打開大氣采樣儀開關(guān)，將袋內(nèi)的空氣吸出；然后，依次關(guān)閉閥門和大氣采樣儀開關(guān)。用聚四氟乙烯軟管依次連接大氣采樣儀出氣口、洗氣瓶和活性炭空氣過濾裝置，并在活性炭空氣過濾裝置的另一端再接一段聚四氟乙烯軟管；先打開大氣采樣儀開關(guān)，通氣10 s，將聚四氟乙烯軟管內(nèi)原有空氣替換成純凈空氣；此時，將連接在活性炭空氣過濾裝置上的聚四氟乙烯軟管與采集桶上的閥門相連，打開閥門向環(huán)繞樹干的采樣桶中充純凈空氣，20 min后關(guān)閉閥門，將過濾和充氣裝置等從采樣桶上撤下。待充入的純凈空氣在采樣桶中平衡20 min后，用聚四氟乙烯硬管連接蘇瑪罐采集孔和采樣桶閥門；同時打開采樣桶和蘇瑪罐閥門，待蘇瑪罐吸滿采樣桶中的氣體(采樣桶的體積不再減小)后關(guān)閉蘇瑪罐閥門，標(biāo)記后帶回實驗室待測(見圖1)。

圖1 紅松主干揮發(fā)物的采集

1.3.2 揮發(fā)物分析

將收集有紅松主干揮發(fā)物的采樣罐連接到7100A預(yù)濃縮儀上(美國ENTECH公司)，濃縮后的樣品進入GC17A/5973N(MS)氣質(zhì)聯(lián)用儀，色譜柱為DB-5石英毛細(xì)管柱(30.00 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為高純氮氣。柱前壓72.6 kPa，進樣口溫度150 ℃，分流進樣，柱流速1.33 mL·min-1，進樣量0.2 μL。程序升溫，初始溫度40 ℃，以5 ℃·min-1的升溫速率升至90 ℃，再以8 ℃·min-1的升溫速率升至250 ℃，保持2 min。MS條件，EI電離，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描范圍m/z為50～500 amu，掃描時間0.14 s。

1.4 數(shù)據(jù)分析

被害株率和平均凝脂團數(shù)按下列公式計算：

被害株率=(被害株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))×100%。

平均凝脂團數(shù)=總凝脂團數(shù)/調(diào)查總株數(shù)。

以z檢驗分析各個種源之間被害株率的差異顯著性；以配對t檢驗分析不同種源紅松平均凝脂團數(shù)的顯著性差異。

揮發(fā)物成分鑒定與相對含量：將分離所得的紅松揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖，采用Xcalibur軟件，通過查詢NIST98.L譜庫，結(jié)合色譜保留時間，進行成分鑒定。通過面積歸一化法計算每種揮發(fā)物的相對含量。

揮發(fā)物相對含量與被害狀況相關(guān)性：把5個種源均含有的各種揮發(fā)物的相對含量、不同種源的被害株率及平均凝脂團數(shù)導(dǎo)入SPSS 23.0，進行雙變量相關(guān)性分析，計算揮發(fā)物相對含量與被害程度的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種源紅松的受害情況

5個種源紅松干部的受害株率均低于50%，但是赤松梢斑螟的危害在這5個種源間存在顯著差異(P<0.05)。被害株率和平均凝脂團數(shù)最高的都是碧水種源，最低的均為立林種源(見表1)。碧水種源的被害株率與立林種源差異顯著(P<0.05)，與其他3個種源間差異不顯著；立林種源的被害株率只顯著地低于碧水種源(P<0.05)，與其他3個種源間差異未達到顯著水平。從平均凝脂團數(shù)看，碧水種源顯著高于立林、宏偉和馬鞍山種源(P<0.05)，但與寒月種源沒有顯著差異；立林種源平均凝脂團數(shù)顯著低于碧水和寒月種源(P<0.05)，但是與宏偉和馬鞍山種源差異不顯著。綜合分析不同種源間的被害株率和平均凝脂團數(shù)的差異顯著性發(fā)現(xiàn)，碧水種源和立林種源在前述2個指標(biāo)上均表現(xiàn)出了顯著差異。因此，可以認(rèn)為這2個種源對赤松梢斑螟寄主選擇的影響存在顯著差異。

表1 不同種源紅松的被害狀況

2.2 不同種源紅松揮發(fā)物種類及揮發(fā)量的差異

從5個種源地的紅松主干中共鑒定出27種主要揮發(fā)性化合物，其中烯萜類占23種。不同種源紅松主干的揮發(fā)物種類之間存在差異，寒月和馬鞍山種源均有22種揮發(fā)物，立林種源有21種，宏偉和碧水種源均是17種。不同種源紅松，即使其揮發(fā)物種類相同，每種揮發(fā)物的相對含量也存在差異，尤其是三環(huán)萜、(1R)-(+)-α-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯等揮發(fā)物在不同種源間的相對含量變化較明顯。其中一些揮發(fā)物只在某個或某兩個種源中存在，例如龍腦烯醛、羅勒烯和乙酸龍腦酯只存在于立林和寒月種源；(-)-α-古巴烯只在宏偉和立林種源分布；(+)-長葉環(huán)烯只見于寒月和馬鞍山種源；(-)-莰烯只在宏偉和碧水種源中檢測到；桉葉油醇只存在于宏偉、馬鞍山種源；檜烯僅存在于馬鞍山種源；萜品油烯只存在于碧水和馬鞍山種源。

宏偉種源揮發(fā)物相對含量最多的是(1R)-(+)-α-蒎烯，并明顯高于該種源其他化合物的含量，其次是β-蒎烯和α-蒎烯；立林種源揮發(fā)物相對含量最多的是(1R)-(+)-α-蒎烯，其次是β-蒎烯和α-蒎烯；碧水種源揮發(fā)物相對含量最多的則是β-蒎烯，其次是(1R)-(+)-α-蒎烯和α-蒎烯；寒月種源揮發(fā)物相對含量最多的是(1R)-(+)-α-蒎烯，其次是β-蒎烯和莰烯；馬鞍山種源揮發(fā)物相對含量最多的是(1R)-(+)-α-蒎烯，其次是3-蒈烯和β-蒎烯(見表2)。

2.3 揮發(fā)物組成和含量與不同種源被害狀況相關(guān)性

2.3.1 揮發(fā)物組成與被害狀況的關(guān)系

對被害株率與平均凝脂團數(shù)均差異顯著的碧水和立林2種源的紅松干部揮發(fā)物比較發(fā)現(xiàn)：被害率和平均凝脂團數(shù)均很少的立林種源有21種揮發(fā)性化合物，比2項指標(biāo)都明顯高的碧水種源多5種；其中莰烯、羅勒烯、龍腦烯醛、乙酸龍腦酯、(-)-α-蓽澄茄油烯、(+)-α-長葉蒎烯和(-)-α-古巴烯只存在于立林種源，碧水種源中不存在這些物質(zhì)；(-)-莰烯和萜品油烯則只存在于碧水種源，立林種源沒有發(fā)現(xiàn)。碧水與其他4個種源相比，未發(fā)現(xiàn)(-)-α-蓽澄茄油烯和(+)-α-長葉蒎烯這2種揮發(fā)性化合物，而其他4個種源中都有這2種揮發(fā)物(見表2)。

2.3.2 揮發(fā)物相對含量與被害狀況的相關(guān)性

為全面了解揮發(fā)物對赤松梢斑螟寄主選擇的影響，在揮發(fā)物組成影響分析的基礎(chǔ)上，利用三環(huán)萜、α-水芹烯、(1R)-(+)-α-蒎烯、α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、α-松油烯、(+)-檸檬烯、(±)-β-水芹烯、γ-松油烯、2-蒈烯和D(+)-樟腦等5個種源紅松均具有的化合物的含量，分析了其與被害株率及平均凝脂團數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系(見表3)。結(jié)果表明，(1R)-(+)-α-蒎烯相對含量與被害株率(P=0.046)及平均凝脂團數(shù)(P=0.012)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；(±)-β-水芹烯相對含量與被害株率(P=0.048<0.05)呈顯著正相關(guān)。

表2 不同種源紅松揮發(fā)物主要化合物和相對含量

表3 不同種源紅松揮發(fā)物相對含量與被害程度間的相關(guān)性

3 討論

赤松梢斑螟對紅松的危害在5個不同種源間存在顯著差異(P<0.05)。被害植株與平均凝脂團數(shù)2項指標(biāo)均差異顯著的是碧水和立林種源。碧水種源的被害株率、平均凝脂團數(shù)均最高，立林種源均最低。極有可能是碧水種源含有某些揮發(fā)物對赤松梢斑螟具有吸引作用[13]，或者立林種源中含有對赤松梢斑螟有驅(qū)避作用的揮發(fā)物[14]，還有可能是在單株隨機排布的林分中，赤松梢斑螟選擇寄主的行為，受到了碧水種源吸引的同時，也受到了來自于其他種源驅(qū)避化合物的驅(qū)使，具體是其他種源中的哪一種或幾種化合物對赤松梢斑螟有驅(qū)避作用還需要進一步室內(nèi)外行為生測試驗加以驗證。

許多研究表明，萜烯類物質(zhì)影響和調(diào)節(jié)昆蟲取食和產(chǎn)卵行為[15-17]。通過對受害嚴(yán)重的種源與受害較輕的種源所含有的植物源揮發(fā)物成分的比較，可以初步認(rèn)為莰烯、羅勒烯、龍腦烯醛、乙酸龍腦酯、(-)-α-蓽澄茄油烯、(+)-α-長葉蒎烯和(-)-α-古巴烯中的某一種(或幾種)對赤松梢斑螟的寄主選擇具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。有報道表明，崁烯對一些昆蟲有驅(qū)避作用，如對松癭小卷蛾(Cydiazebeana)雌雄蟲均有驅(qū)避作用[14]；含有崁烯的揮發(fā)性混合物對鱗翅目昆蟲誘集效果也相對不理想[18]。崁烯對稻飛虱(Nilaparvatalugens)也有驅(qū)避作用[19]，而且不同比例的崁烯和乙酸龍腦脂混合能在一定程度上增強其驅(qū)避能力[20]，這很可能是立林種源被害輕而碧水種源被害重的原因之一。但是，具體是哪一種揮發(fā)物或者是哪幾種揮發(fā)物的存在以及其適當(dāng)比例的混合對赤松梢斑螟影響更強，還需行為選擇試驗的進一步驗證。

三環(huán)萜、α-水芹烯、(1R)-(+)-α-蒎烯、α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、α-松油烯、(+)-檸檬烯、(±)-β-水芹烯、γ-松油烯、2-蒈烯和D(+)-樟腦為5個種源共有物質(zhì)。這些揮發(fā)性化合物相對含量與受害程度的相關(guān)性分析表明，(1R)-(+)-α-蒎烯與被害株率和平均凝脂團數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；而(±)-β-水芹烯與被害株率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。極可能這2種物質(zhì)在某濃度下對赤松梢斑螟的寄主定位、取食和產(chǎn)卵等行為過程起了重要的調(diào)控作用[21-24]。但在寄主選擇的哪個具體過程中，起到了什么作用尚需進一步研究。