曹亞從 顧曉振 張正海 于海龍 馮錫剛 張南南 張偉麗景雅欣 王海平 李錫香 Beno?t MOURY 張寶璽 王立浩*

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所， 北京 100081； 2. 法國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物病理研究所，阿維尼翁 84143）

辣椒（Capsicum spp.）屬于茄科辣椒屬，起源于南美洲。1493年，哥倫布首次將辣椒引入歐洲，并于15至16世紀(jì)后期引入東亞[1]，由于復(fù)雜的地理環(huán)境以及人們的馴化等活動(dòng)，形成了豐富的辣椒種質(zhì)資源。遺傳多樣性使育種者可以利用種質(zhì)資源中不同的等位基因來培育品種，等位基因挖掘已經(jīng)被用來在已知基因座上發(fā)現(xiàn)未探索的等位基因多樣性，是利用資源多樣性育種的基礎(chǔ)。

我國是世界上辣椒種植面積最大的國家（http：//www.FAO.org）。自2015年以來，辣椒已成為我國播種面積最大的蔬菜作物，年播種面積150萬 ～200萬hm2[2]。馬鈴薯Y病毒屬包括多個(gè)種，是一種世界性的病害。1956年Simons首次報(bào)道在美國加州有PVY侵染辣椒[3]。在中國，20世紀(jì)80年代馬鈴薯Y病毒屬對辣椒的危害就有廣泛報(bào)道[4-6]。近年來報(bào)道危害辣椒的馬鈴薯Y病毒屬病毒有馬鈴薯Y病毒（Potato Virus Y，PVY）、煙草蝕紋病毒（Tobacco Etch Virus，TEV）、辣椒斑駁病毒（Pepper Mottle Virus，PepMoV）、辣椒脈斑?。≒epper Veinal Mottle Virus，PVMV）等[7-14]，嚴(yán)重影響辣椒的生產(chǎn)效益，尤其在高溫地區(qū)，是辣椒的重要病害，其危害僅次于CMV和TMV[15-16]。

eIF4E是植物對抗病毒的重要決定因子[17-20]，酵母雙雜交及ELISA實(shí)驗(yàn)表明病毒基因組連接蛋白（VPg）或其前體（NIa）可以與eIF4E或其同源異構(gòu)體Eif（iso）4E相互作用，而互作缺失的病毒則喪失侵染性[21-22]。在辣椒中同樣發(fā)現(xiàn)了與馬鈴薯Y病毒屬病毒PVY和TEV抗性相關(guān)的eIF4E[23-25]，根據(jù)發(fā)現(xiàn)的抗性及發(fā)現(xiàn)時(shí)間先后順序，Kyle和Palloix[26]將其命名為pvr2，后證明pvr1與pvr2為等位基因。pvr2-eIF4E序列多樣性豐富，感病等位基因?yàn)閜vr2+，繼pvr2 1和pvr2 2被發(fā)現(xiàn)后[24,27-29]，Charron等[30]對25份辣椒材料 （Capsicum annuumL.）的研究發(fā)現(xiàn)了pvr2的10個(gè)等位基因，在此10個(gè)等位基因中，有7個(gè)前人未報(bào)道，分別命名為pvr2 3-9。Ibiza等[31]采用EcoTILLING的方法，在233個(gè)辣椒栽培品種中發(fā)現(xiàn)了16個(gè)pvr2的等位基因，其中有13個(gè)等位基因前人未報(bào)道，分別命名為pvr2 10-22。pvr2-eIF4E序列的多樣性導(dǎo)致其功能差異，體現(xiàn)在對不同PVY小種（PVY0、PVY0,1、PVY0,1,2）[29]和TEV的抗性差異。

對pvr2-eIF4E的多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，其外顯子的多態(tài)性比例高于內(nèi)含子[30]，因此pvr2-eIF4E的研究重點(diǎn)位于其外顯子。pvr2-eIF4E基因具有5個(gè)外顯子，研究表明外顯子1的多態(tài)性最豐富[30-31]，因此本課題組前期對外顯子1的多態(tài)性進(jìn)行了研究[32]，在1 904份材料中共發(fā)現(xiàn)17個(gè)單倍型，14個(gè)有義突變位點(diǎn)。

我國有著豐富的辣椒種質(zhì)資源，但是pvr2-eIF4E作為辣椒抗PVY和TEV育種工作中有效而穩(wěn)定的抗源，并未在豐富的資源中得到廣泛而深入的研究。本研究通過全面鑒定pvr2-eIF4E的所有外顯子，挖掘出我國辣椒資源中的PVY和TEV抗性材料，為PVY和TEV抗性材料的挖掘和利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

我國種質(zhì)資源中期庫1 863份辣椒材料，其中187份材料引種自國外，引種地區(qū)包括美洲、歐洲、非洲、亞洲的26個(gè)國家；1 676份材料來自于中國33個(gè)省、市、自治區(qū)。

1.2 基因組DNA提取

辣椒材料播種于穴盤，待長到約6片真葉時(shí)，取嫩葉片，采用改良CTAB方法提取葉片基因組DNA[33]。采用Biospec-nano顯微分光光度計(jì)（Shimadzu Corporation）測定DNA的濃度及質(zhì)量。基因組DNA稀釋到25 ng/L備用。

1.3 擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

通過美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的Yolo Wonder的pvr2-eIF4E的編碼序列確定目的基因序列（AY122052.1）。將序列比對到CM334 v1.55版 本 基 因 組[34]（http://passport.pepper.snu.ac.kr/?t=PGENOME），得到pvr2-eIF4E在CM334基因組中的基因?yàn)镃A04g00860。

利用在線工具Primer 3（http://primer3.ut.ee/）設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增外顯子，擴(kuò)增引物見表1。

表1 pvr2-eIF4E外顯子測序引物序列Table 1 Sequences of pvr2-eIF4E exon sequencing primers

1.4 產(chǎn)物擴(kuò)增及測序

以葉片基因組DNA為模板，分別對外顯子1、外顯子2-3和外顯子4-5進(jìn)行擴(kuò)增，采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的DNA高保真聚合酶試劑盒（TransStart ? Top taq DNA Polymerase），擴(kuò)增體系為30 μL：2 μL 基因組DNA，0.6 μL高保真聚合酶，3 μL 緩沖液（10 X），2.4 μL dNTP，上下游引物各1.2 μL，19.6 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3min；94 ℃ 30 S，58 ℃ 30 S，72 ℃ 60 S，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行Sanger測序，測序引物采用擴(kuò)增正向引物。對含有新發(fā)現(xiàn)等位基因的材料進(jìn)行3次重復(fù)測序。

1.5 測序結(jié)果分析

將測序結(jié)果在Cexpress軟件中打開，序列對齊后根據(jù)Yolo Wonder的編碼序列，確定各材料的堿基突變位點(diǎn)，用MEGA5.0對測序序列進(jìn)行多重比對，統(tǒng)計(jì)各材料間氨基酸差異位點(diǎn)。

1.6 PVY抗性接種鑒定

對含有新發(fā)現(xiàn)等位基因的材料進(jìn)行PVY抗性接種鑒定。鑒定工作委托法國農(nóng)業(yè)科學(xué)院完成，接種PVY病毒株系為LYE84.2和SON41，其中LYE84.2為PVY0，SON41為PVY0,1,2。

1.7 PVY抗性材料遺傳關(guān)系分析及核心種質(zhì)構(gòu)建

利用Gu等[35]SSR數(shù)據(jù)，提取含有抗性等位基因材料的數(shù)據(jù)，將其轉(zhuǎn)化為矩陣，通過DARWin軟件（https://darwin.cirad.fr/）對含有抗性等位基因的材料構(gòu)建進(jìn)化樹。

根據(jù)進(jìn)化樹將材料進(jìn)行分組，對每種pvr2等位基因在每個(gè)組中提取遺傳距離最遠(yuǎn)的兩份材料，分組中少于2份的，則提取實(shí)際材料數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pvr2-eIF4E基因序列多樣性分析

在PCR擴(kuò)增測序的1 863份辣椒材料中，發(fā)現(xiàn)的變異均為SNP，共檢測到10個(gè)有義氨基酸突變位點(diǎn)（表2），共檢測到10種等位基因，其中有1 117份材料與感病材料Yolo Wonder有相同的氨基酸序列，為pvr2+；有8種等位基因與前人已報(bào)道等位基 因pvr2 1、pvr2 2、pvr2 3、pvr2 4、pvr2 6、pvr2 7、pvr2 9、pvr1 +編碼序列一致，共744份材料；有1份材料為新發(fā)現(xiàn)的等位基因，命名為pvr223，在第1外顯子的第185位堿基發(fā)生突變，導(dǎo)致編碼苯丙氨酸的密碼子（UGG）突變?yōu)榻K止密碼子（UAG）（圖1）。以感病材料Yolo Wonder編碼區(qū)序列為對照，1 863份材料中共有746份發(fā)生有義氨基酸突變，約占總數(shù)的41%。

突變位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（表2），突變位點(diǎn)主要位于第1外顯子，有7個(gè)位點(diǎn)發(fā)生有義突變，在第2、3、4外顯子分別有1個(gè)有義突變，在第5外顯子未發(fā)現(xiàn)有義突變。突變位點(diǎn)最多的位點(diǎn)位于第1外顯子的第67位氨基酸，有644份材料發(fā)生有義突變；其次為第205、71、79位氨基酸，分別有232、97、20份材料發(fā)生有義突變，其余位點(diǎn)發(fā)生突變的材料很少。

2.2 pvr2-eIF4E等位基因抗性分析

在1 863份辣椒材料發(fā)現(xiàn)的10種pvr2-eIF4E等位基因中，已知有2種等位基因?yàn)楦胁。?種等位基因?qū)VY和TEV部分小種具有抗性（表2），1種等位基因的抗性未知。

表2 pvr2-eIF4E基因多樣性分析Table 2 Analysis of pvr2-eIF4E gene diversity

采用PVY株系LYE84.2（PVY0）和SON41（PVY0,1,2），對含有新發(fā)現(xiàn)等位基因pvr223的辣椒材料進(jìn)行PVY抗性接種鑒定。結(jié)果顯示，含有pvr223的辣椒材料易感此2種PVY株系（表3）。

表3 人工接種鑒定pvr223等位基因材料對PVY抗性的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)Table 3 Summary on the resistances of materials with pvr223 allele to PVY measured by artificial inoculation

在研究的1 863份辣椒材料中，共有649份材料含有pvr2抗性等位基因，占總材料數(shù)的34.84%。649份材料均對PVY0具有抗性，占總材料數(shù)的34.84%；其中有6份材料含有高抗PVY等位基因（pvr2 6、pvr2 7、pvr2 9），對PVY0,1,2具有抗性，占總材料數(shù)的0.32%；有1份材料含有已報(bào)道抗TEV的等位基因pvr2 2。

2.3 含有抗PVY的pvr2-eIF4E等位基因材料地理分布

抗性材料主要來源于我國國內(nèi)，有586份，占抗性材料的90.29%；有63份抗性材料來源于國外，占抗性材料的9.71%（圖2）。國內(nèi)的抗性材料主要來源于湖北，有134份，占國內(nèi)抗性材料的22.87%，其次來自于湖南、云南和四川，分別有52、49和42份，占國內(nèi)抗性材料的8.87%、8.36%和7.17%。收集自國外的抗性材料主要來源于美國，有25份，占國外抗性材料的39.68%，其次來自于泰國、印度和荷蘭，分別有9、5和4份，占國外抗性材料的14.29%、7.94%和6.35%。

含有高抗PVY等位基因（pvr2 6、pvr2 7、pvr2 9）的材料分別來自于中國山西（1份）、美國（2份）、墨西哥（1份）、西班牙（1份），另有1份引自國外，引進(jìn)地不詳。含有已報(bào)道抗TEV的pvr22材料來自英國。

圖2 含有抗PVY等位基因材料的地理分布圖 A，在不同國家之間的分布；B，在中國各地的分布Figure 2 Geographical distribution of materials containing PVY-resistant alleles. A, distribution among diあerent countries；B, distribution throughout China.

2.4 含有抗PVY的pvr2-eIF4E等位基因材料遺傳關(guān)系分析

基于SSR標(biāo)記的分型數(shù)據(jù)，對649份辣椒抗性材料的遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析（圖3）。根據(jù)遺傳關(guān)系可以將含有pvr2抗性等位基因的材料分為3個(gè)群，如圖3所示，其中群I包含本研究中鑒定到的所有抗性等位基因，又分為3個(gè)亞群；群II包含4種抗性等位基因（pvr2 1、pvr2 3、pvr2 4、pvr2 9），又分為3個(gè)亞群；群III包含3種抗性等位基因（pvr2 1、pvr2 3、pvr2 4），又分為4個(gè)亞群。

2.5 PVY抗性核心種質(zhì)構(gòu)建

結(jié)合SSR標(biāo)記分型數(shù)據(jù)構(gòu)建的遺傳關(guān)系和pvr2等位基因，抽取PVY抗性核心種質(zhì)，每個(gè)亞群中抽取每個(gè)pvr2等位基因2份，抽取在進(jìn)化樹上遺傳距離最遠(yuǎn)的2份，少于2份的則抽取實(shí)際數(shù)據(jù)材料。PVY抗性核心種質(zhì)材料共抽取53份，具體見表4。

圖3 含有抗性pvr2等位基因材料的遺傳關(guān)系圖Fig. 3 Genetic relationship of accessions containing resistant pvr2 alleles

3 討論

pvr2-eIF4E基因產(chǎn)生抗性的確切機(jī)制仍有待闡明，對pvr2基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析表明，植物感病與否的表型差異是由pvr2氨基酸變化決定的，而不是因?yàn)槠渌{(diào)節(jié)eIF4E表達(dá)的因子決定[40]。已有報(bào)道的蛋白互作研究認(rèn)為，pvr2-eIF4E基因發(fā)揮抗性作用，是由于病毒Vpg蛋白和植物eIF4E蛋白的互作被破壞，病毒Vpg不能結(jié)合到eIF4E，從而影響病毒的復(fù)制、移動(dòng)等[36,40]。通過結(jié)構(gòu)模型預(yù)測，認(rèn)為pvr2的突變位點(diǎn)位于蛋白的表面，第62～79位氨基酸被定義為蛋白結(jié)構(gòu)域I，第106～109位氨基酸被定義為蛋白結(jié)構(gòu)域II，這兩個(gè)區(qū)域可能是pvr2-eIF4E與PVY和TEV互作的關(guān)鍵區(qū)域，參與對PVY的抗性[41-42]。本研究發(fā)現(xiàn)的新等位基因pvr223的突變發(fā)生在第1外顯子的第62位氨基酸，由苯丙氨酸突變?yōu)榻K止密碼子，使原本含228個(gè)氨基酸的蛋白突變?yōu)閮H有62位氨基酸的蛋白。雖然新發(fā)現(xiàn)等位基因pvr223僅保留了很短的蛋白序列，保留的序列不存在前人報(bào)道的與Vpg互作的候選關(guān)鍵區(qū)域，但仍然感病，因此pvr2-eIF4E可能存在其他抗病相關(guān)作用位點(diǎn)及作用機(jī)制，或含有pvr2 23-eIF4E的材料存在其他基因編碼與PVY病毒Vpg蛋白互作的蛋白。

辣椒傳入我國較晚，遺傳背景比較狹窄，本研究鑒定的辣椒資源多收集于“七五”、“八五”期間，多數(shù)未利用多抗性材料經(jīng)過抗性轉(zhuǎn)育，因此，雖然我國有大量含PVY抗性等位基因的材料，但是多樣性不夠豐富，多抗性差：含有抗多個(gè)PVY小種的基因型等位基因pvr2 6、pvr2 7、pvr2 9材料僅有6份，且有5份是引種自國外；含有已報(bào)道抗TEV基因型等位基因pvr2 2的材料僅有1份。近年來，各地多有報(bào)道PVY和TEV病毒在辣椒上引起的危害[7-9,11,13,15,43-44]，我國現(xiàn)存種質(zhì)資源中缺少PVY和TEV高抗材料，需要引起重視，今后要加強(qiáng)引入豐富的pvr2抗性等位基因材料，用以培育豐富類型的多抗PVY和TEV辣椒品種。

表4 PVY抗性核心種質(zhì)材料抽取情況Table 4 Extraction of PVY resistant core germplasm