徐 輝 唐言華 劉繼武 王 亮（貴陽市第一人民醫(yī)院胃腸外科，貴陽550002）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是胃腸道常見惡性腫瘤，隨人口老齡化及生活飲食習(xí)慣改變，其發(fā)病率與死亡率呈上升趨勢［1］。醫(yī)療技術(shù)進(jìn)步使化療及靶向治療廣泛應(yīng)用于CRC治療，但患者5年生存率僅為49%左右，研究認(rèn)為與其侵襲及轉(zhuǎn)移無法被有效抑制相關(guān)［2-3］。近期研究報道，控制CRC侵襲與轉(zhuǎn)移需抑癌基因、癌基因及其基因產(chǎn)物等基因調(diào)控及免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子等應(yīng)答細(xì)胞亞群參與［4］。CRC大鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，獲得性免疫細(xì)胞CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、T輔助細(xì)胞1（Thelper cell 1，Th1）、Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）在CRC大鼠癌組織中呈高表達(dá)，且與腸道細(xì)胞損傷密切相關(guān)［5］。臨床研究指出，CRC患者腫瘤組織中可檢測到各種應(yīng)答細(xì)胞亞群及趨化因子CXCL12、CCL20-CCR6、CX3CLI-CX3CR1和CX3CL1，提示趨化因子與應(yīng)答細(xì)胞亞群進(jìn)入癌組織相關(guān)［6］。進(jìn)一步探討CRC形成機(jī)制發(fā)現(xiàn)，腸道共生細(xì)菌可刺激免疫細(xì)胞浸潤腸道固有層釋放促炎細(xì)胞因子形成應(yīng)答細(xì)胞亞群，對腫瘤細(xì)胞生長起抑制作用，但其與趨化因子的關(guān)系尚未闡明。因此，本研究探討CRC組織中應(yīng)答細(xì)胞亞群、趨化因子與腸道微環(huán)境間的關(guān)系，構(gòu)建微環(huán)境觸發(fā)的CRC細(xì)胞系以明確腸道微生物群過表達(dá)對趨化因子及對CRC細(xì)胞免疫應(yīng)答行為的影響。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 收集2017年1月至2019年1月我院收治的41例CRC患者的癌組織及癌旁正常組織，男性28例，女性13例，年齡40～79歲，平均年齡（66.14±10.67）歲；高分化6例，中分化27例，低分化8例；Dukes分期A/B期29例，C/D期12例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合《結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2010年版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；②未接受放化療治療；③病例資料齊全；④入院前無重大出血病史；⑤肝、腎、心功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②治療耐受性差；③術(shù)前接受生物學(xué)治療或內(nèi)分泌治療；④患者對本研究有異議；⑤近期使用過免疫調(diào)節(jié)劑或激素類藥物。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理會批準(zhǔn)，所有患者及家屬知情同意。

1.1.2 實驗動物 雄性SPF級NSG小鼠24只，體重15.32～19.67 g，6～8周齡，購自北京醫(yī)療器械檢驗所，許可證號：SCXK（青）2018-0031。動物使用和處理符合《國家衛(wèi)生研究院實驗動物保護(hù)法和使用指導(dǎo)》要求，經(jīng)過醫(yī)學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，審批號：20180209，于醫(yī)學(xué)院實驗動物研究中心［SYXK（青）2018-0411］完成實驗，室溫18～22℃、濕度45%～50%、12 h明/12 h暗交替，自由攝食攝水。

1.1.3 主要試劑 總RNA提取試劑盒（上海碩嘉生物）；DNA提取試劑盒（邁瑞生物）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京中生柏奧生物）；miRNA-21引物（蘇州吉瑪基因）；瓊脂糖（上?？禎櫳铮籔CR反應(yīng)液（北京索萊寶）；DEPC水（四川康百瑞生物）；Trizol溶液（北京百奧森泰生物）；RT-PCR擴(kuò)增試劑盒（Sigma）；Trizol裂解液（北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司）；氨芐青霉素鈉/氨芐西林鈉（先泰藥業(yè)）；鹽酸萬古霉素（浙江海正）；BCA試劑盒（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司）；CXCL12、CCL20-CCR6、CX3CLI-CX3CR1、CX3CL1單克隆抗體一抗（北京百奧萊博科技有限公司）：GAPDH單克隆抗體一抗（廈門研科）；山羊抗兔二抗（武漢賽維爾生物）；ECL發(fā)光試劑盒（上海古朵）。

1.2 方法

1.2.1 體內(nèi)實驗 NSG小鼠腹膜和腸內(nèi)注射LS180細(xì)胞生成腫瘤異種移植物構(gòu)建腸內(nèi)腫瘤模型；從第10天開始，將1 g/L氨芐青霉素鈉/氨芐西林鈉和0.2 g/L鹽酸萬古霉素溶于飲用水中給藥，第29天，將攜帶腫瘤小鼠采用CFSE標(biāo)記的CD4+和CD8+T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移，從主要CRC樣品中分離并于體外擴(kuò)增（5×106個/只），2 d后采用流式細(xì)胞術(shù)在消化腫瘤的細(xì)胞懸浮液中評估轉(zhuǎn)移T細(xì)胞群頻率。

1.2.2 RT-PCR 采用總RNA提取試劑盒提取CRC和癌旁正常組織中總RNA，RNA中基因組DNA消除并除去DNase1后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：SYBR Green Mix 10μl，上游引物5 mol，下游引物5 mol，cDNA模板1μl，ddH2O ddH2O 8μl，總體積20μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性5 s，56℃退火10 s，72℃延伸25 s，39次循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，測定各擴(kuò)增帶吸光度，以目的基因與β-actin吸光度比值計算CD4+、CD8+、Th1、Foxp3+表達(dá)。

1.2.3 Western blot 取CRC和癌旁正常組織細(xì)胞，裂解，勻漿，離心，提取蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取總蛋白上樣，電泳，切膠，濕轉(zhuǎn)，TBS-T封閉，加入CXCL12、CCL20-CCR6、CX3CLI-CX3CR1、CX3CL1單克隆抗體一抗（1：300）、GAPDH單克隆抗體一抗（1：1 000），4℃孵育過夜，洗膜，加入山羊抗兔二抗，37℃孵育60 min，洗膜，ECL發(fā)光試劑盒顯色，洗片，顯影、定影，以GAPDH為內(nèi)參，成像掃描分析系統(tǒng)測定內(nèi)參和目的條帶灰度值。

1.2.4 腸道菌群檢測 取濕重糞便樣品反復(fù)離心，去除雜質(zhì)，洗滌獲取菌體，L棒均勻涂抹于不同培養(yǎng)基，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA，引物根據(jù)目標(biāo)細(xì)菌16SrRNA設(shè)計；糞便細(xì)菌DNA樣品與標(biāo)準(zhǔn)品（1：10稀釋）同時進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，每次反應(yīng)條件及反應(yīng)體系相同，反應(yīng)結(jié)束后采用溶解曲線分析PCR產(chǎn)物特異性，每g糞便樣品待測細(xì)菌基因的拷貝數(shù)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線及Ct值，通過菌落形態(tài)、格蘭染色鏡檢、生化反應(yīng)等鑒定菌落數(shù)作為定量結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，基因表達(dá)水平比較采用Wilcoxon符號秩檢驗；根據(jù)公式（Spearmanr值×對應(yīng)趨化因子受體陽性細(xì)胞百分比）計算T細(xì)胞標(biāo)志物顯著相關(guān)趨化因子得分；USEARCH軟件（V.8.1.1861）分析序列；DESeq2軟件（V.1.12.4）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化豐度計數(shù)的操作分類單位差異分析；Microsynth AG進(jìn)行基因庫、測序和數(shù)據(jù)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T細(xì)胞群表達(dá)比較 本研究在62個CRC和相應(yīng)無腫瘤結(jié)腸組織中分析了編碼免疫細(xì)胞標(biāo)志物的基因表達(dá)，包括總T細(xì)胞（CD3）、T輔助細(xì)胞（CD4）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）（CD8）、Th1（Tbet和IRF-1）、Th2（IL-4、IL-5和IL-13）、Th17（IL-17）、Tfh（CXCR5）及Tregs（Foxp3+），結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD8+、Th1、Foxp3+T細(xì)胞標(biāo)志物均有表達(dá)，IL-4、IL-5在所有樣品中均未檢測到表達(dá)（數(shù)據(jù)未顯示），其余僅在少數(shù)樣品中表達(dá)，表明CRC中Th1、Th2、Tfh細(xì)胞的CRC浸潤微弱。CD4+、CD8+、Th1、Foxp3+在CRC組織中均有表達(dá)；CRC組織中CD4+表達(dá)低于癌旁正常組織（P＜0.05），CD8+、Th1、Foxp3+表達(dá)高于癌旁正常組織（P＜0.05），見表1。

2.2 趨化因子表達(dá)比較 CXCL12、CCL20-CCR6、CX3CLI-CX3CR1、CX3CL1在CRC組織中均有表達(dá)；CRC組織CXCL12表達(dá)低于癌旁正常組織（P＜0.05），CCL20-CCR6、CX3CLI-CX3CR1、CX3CL1表達(dá)高于與癌旁正常組織（P＜0.05），見表2。

2.3 T細(xì)胞群與趨化因子過表達(dá)相關(guān)性分析 CD4+、CD8+、Th1、Foxp3+與CXCL12、CCL20-CCR6、CX3CLICX3CR1、CX3CL1均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），見表3。無監(jiān)督層次分析中，樣本聚集于3個主要組：第1組特征為多數(shù)T細(xì)胞標(biāo)志物過度表達(dá)（簇高），第2組顯示異質(zhì)表達(dá)（簇中），第3組特征為所有T細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)下調(diào)（簇低），見圖1。

2.4 趨化因子與T細(xì)胞亞群CRC浸潤的關(guān)系 CD4+相關(guān)趨化因子特征主要包括CXCL12、CCL20-CCR6、CX3CLI-CX3CR1，CD8+相關(guān)趨化因子特征主要包括CXCL12、CX3CLI-CX3CR1、CX3CL，Th1相關(guān)趨化因子特征主要包括CX3CLI-CX3CR1、CX3CL，F(xiàn)oxp3+相關(guān)趨化因子特征主要包括CXCL12、CCL20-CCR6（圖2）。

表1 T細(xì)胞群表達(dá)比較（±s，n=41，%）Tab.1 Comparison of T cell subgroups expressions（±s，n=41，%）

表1 T細(xì)胞群表達(dá)比較（±s，n=41，%）Tab.1 Comparison of T cell subgroups expressions（±s，n=41，%）

Groups CRCtissue Adjacent tissue t P CD4+0.22±0.08 2.69±0.63 24.904＜0.001 CD8+4.11±1.33 0.48±0.30 17.048＜0.001 Th1 6.77±2.03 3.02±0.59 11.358＜0.001 Foxp3+4.32±1.26 0.69±0.05 18.433＜0.001

表2 趨化因子表達(dá)比較（±s，n=41）Tab.2 Comparison of chemokineexpressions（±s，n=41）

表2 趨化因子表達(dá)比較（±s，n=41）Tab.2 Comparison of chemokineexpressions（±s，n=41）

Groups CRCtissue Adjacent tissue t P CXCL12 0.16±0.05 3.67±1.10 20.411＜0.001 CCL20-CCR6 4.53±1.20 2.02±0.64 11.818＜0.001 CX3CLI-CX 3CR1 2.69±0.54 0.23±0.09 28.773＜0.001 CX3CL1 4.77±1.32 3.35±1.01 5.471＜0.001

表3 T細(xì)胞群與趨化因子過表達(dá)相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between T cell subsets and chemokine overexpression

圖1 無監(jiān)督層次聚類圖Fig.1 Unsupervised hierarchical clustering image

圖2 趨化因子與T細(xì)胞亞群CRC浸潤的關(guān)系Fig.2 Relationship between chemokines and infiltration of CRC in T cell subsets

2.5 T細(xì)胞匯聚趨化因子圖 體內(nèi)培養(yǎng)CRC細(xì)胞中趨化因子均呈高表達(dá)，體內(nèi)CRC組織中CRCCXCL12、CCL20-CCR6、CX3CLI-CX3CR1、CX3CL表達(dá)高于體外CRC組織中基因表達(dá)水平（P＜0.05），見圖3。

2.6 腸道微生物群對CRC細(xì)胞趨化因子表達(dá)的影響 本研究假設(shè)腫瘤細(xì)胞中趨化因子的產(chǎn)生可能由腸道菌群衍生微生物刺激引發(fā)，采用T細(xì)胞激動劑刺激正常細(xì)胞系和CRC細(xì)胞系誘導(dǎo)其趨化因子基因重新表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激動劑刺激CRC細(xì)胞系后 趨 化 因 子CXCL12、CCL20-CCR6、CX3CLICX3CR1、CX3CL與腸道微生物群各因子可同時表達(dá)，且趨化因子表達(dá)水平與腸道微生物群因子相關(guān)，見圖4。

2.7 腸道微生物群與T細(xì)胞浸潤的關(guān)系 體內(nèi)腫瘤T細(xì)胞群遷移率高于體外腫瘤（P＜0.05），見圖5。

圖3 T細(xì)胞募集趨化因子圖Fig.3 Imagesof chemokines recruited by T cells

圖4 腸道微生物群對CRC細(xì)胞趨化因子表達(dá)的影響Fig.4 Effect of intestinal microflora on expressions of che?mokines in CRC cells

圖5 腸道微生物群與T細(xì)胞浸潤的關(guān)系Fig.5 Relationship between intestinal microflora and T cell infiltration

3 討論

作為常見消化道惡性腫瘤，CRC發(fā)病率與病死率均顯著上升［8］。REX等［9］回顧性分析顯示，CRC患者中位無進(jìn)展生存期為89.0個月，中位總生存期為129.0個月，與歐美國家相比總生存期延長。但腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移為多步驟、多因素、多階段的復(fù)雜過程，CRC細(xì)胞脫落后沿組織間隙侵襲蔓延至淋巴管，在淋巴循環(huán)中轉(zhuǎn)運、滯留、擴(kuò)散并增殖，單個或幾個CRC細(xì)胞發(fā)展為微轉(zhuǎn)移灶，導(dǎo)致CRC患者短期生存率逐年下降。TIAN等［10］認(rèn)為抑制CRC發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移應(yīng)關(guān)注其內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞因子水平變化。

研究證實，趨化因子是維持腸道正常菌群的必需因子，與患者生存改善相關(guān)［11］；多個研究結(jié)果顯示，C類因子在多種惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［12-13］；趨化因子為腫瘤相關(guān)因子，C類因子是由效應(yīng)細(xì)胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白，CXCL蛋白為cl-2原癌基因編碼產(chǎn)物，是促細(xì)胞存活因子，通過組織細(xì)胞色素c從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)抑制細(xì)胞凋亡［14］。cl-2為細(xì)胞凋亡重要通路，研究表明，cl-2抑制劑已成為CRC治療的新型藥物［15］。CCL-CCR是一種能使細(xì)胞無限增殖并促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。HAN等［16］研究發(fā)現(xiàn)，CCL20-CCR6因子在肺癌患者中高表達(dá)，并與TNM分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)，其過度表達(dá)的患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險明顯升高。QIAN等［17］研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腺癌患者體內(nèi)CX3類蛋白呈低表達(dá)，參與癌癥發(fā)生發(fā)展過程，主要機(jī)制為降解細(xì)胞內(nèi)蛋白導(dǎo)致其死亡。SHIBUTANI等［18］采用免疫組化方法分析CRC細(xì)胞體內(nèi)外細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)細(xì)胞因子水平更高，考慮細(xì)胞因子參與癌細(xì)胞免疫機(jī)制、可抑制細(xì)胞生長誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CRC細(xì)胞在生長過程中快速增殖，代謝異常，機(jī)體供血不足導(dǎo)致CRC細(xì)胞耗氧量增加發(fā)生病理性缺氧，而病理性缺氧可刺激CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、Th1細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，從而調(diào)節(jié)微環(huán)境生成以緩解病理性缺氧［19］。提示趨化因子通過募集特定T細(xì)胞群共同作用于癌組織發(fā)揮作用。

本研究選取CRC組織和癌旁正常組織進(jìn)行檢測，通過分析趨化因子、T細(xì)胞亞群表達(dá)水平及其與腸道微生物群關(guān)系闡明其可促進(jìn)T細(xì)胞亞群激活CRC細(xì)胞浸潤。關(guān)于CRC微環(huán)境觸發(fā)因素的報道較少，但對糞便樣本進(jìn)行腸道微生物群分析可將CRC或癌前息肉檢出率提高5倍，說明腸道微生物群是CRC的作用機(jī)制［20］。腸道微生物群可控制人體對癌癥治療藥物的反應(yīng)［21］。腫瘤可破壞腸道黏液層，腸道細(xì)菌進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，部分可募集至淋巴結(jié)的細(xì)菌可促進(jìn)趨化因子生成，促進(jìn)免疫細(xì)胞形成并攻擊癌細(xì)胞［22］。本研究顯示，CRC組織T細(xì)胞標(biāo)志物和趨化因子表達(dá)水平高于癌旁正常組織，提示T細(xì)胞亞群和趨化因子在CRC檢測中的特異性，與既往研究結(jié)果相似。本研究通過受體譜間相關(guān)性分析確定CRC組織中顯著趨化因子特征及與免疫細(xì)胞群水平，在2個蛋白相對表達(dá)的隊列中可見，CCL、CXCR配體與CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、Th1、Foxp3+、Tregs可同時表達(dá)，說明趨化因子與T細(xì)胞亞群浸潤相平行。CCL、CXCR配體表達(dá)與CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、Th1、Foxp3+、Tregs顯著相關(guān)，提示趨化因子與T細(xì)胞亞群受某種因素影響募集，對CRC發(fā)生發(fā)展具有重要意義。細(xì)胞亞群因子間表達(dá)特征相似，且T細(xì)胞因子與Tregs、Th1顯示趨化因子受體譜相似，提示CRC組織中T細(xì)胞與趨化因子具有相同募集，進(jìn)一步驗證其相關(guān)性。而趨化因子吸引有益T細(xì)胞群，共同抑制癌細(xì)胞增殖和分化，有助于CRC預(yù)后改善。本研究證實了T細(xì)胞群和趨化因子表達(dá)的相關(guān)性及其對療效改善具有重要價值；但受前瞻性分析的限制，未對預(yù)后進(jìn)行評估。為研討T細(xì)胞募集趨化因子的細(xì)胞來源，腫瘤細(xì)胞對趨化因子的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，從體內(nèi)和體外分離的CRC細(xì)胞并對其沉默RNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)培養(yǎng)的CRC原代細(xì)胞顯示出更高的趨化因子基因表達(dá)水平。體內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)主要受內(nèi)環(huán)境影響；湯鈺琪等［23］在小樣本實驗中證實，腸道腫瘤細(xì)胞中，微環(huán)境刺激對調(diào)節(jié)趨化因子表達(dá)作用更強(qiáng)。腸道微環(huán)境與趨化因子有一定相關(guān)性，可能促進(jìn)其表達(dá)上調(diào)。既往研究表明，腫瘤上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)移的腸道共生細(xì)菌可能與腫瘤細(xì)胞相互作用并誘導(dǎo)腫瘤生成，也可釋放促腫瘤生成細(xì)胞因子［24］。T細(xì)胞群在促腫瘤生成中起重要作用，本研究也證明腸道細(xì)菌可使更多T細(xì)胞募集至腫瘤異種移植物中，可能與腸道共生細(xì)菌可控制有益免疫細(xì)胞腫瘤浸潤有關(guān)。體外實驗結(jié)果顯示，不同種類CRC相關(guān)細(xì)菌均可在不同程度促進(jìn)T細(xì)胞募集趨化因子基因表達(dá)，進(jìn)一步說明腸道微環(huán)境與T細(xì)胞群、趨化因子的相關(guān)性。于鑫等［25］研究顯示，趨化因子誘導(dǎo)的T細(xì)胞主要通過影響腸癌微環(huán)境相關(guān)因子分泌而導(dǎo)致腸道失衡，本研究體外實驗可證實該觀點。本研究假設(shè)腫瘤細(xì)胞中趨化因子產(chǎn)生可能由腸道菌群衍生微生物刺激引發(fā)，T細(xì)胞激動劑刺激正常細(xì)胞系和CRC細(xì)胞系，誘導(dǎo)其趨化因子基因重新表達(dá)，發(fā)現(xiàn)激動劑刺激CRC細(xì)胞系后趨化因子CXCL12、CCL20-CCR6、CX3CLICX3CR1、CX3CL與腸道微生物群各因子可同時表達(dá)，且趨化因子表達(dá)水平與腸道微生物群因子具有一定相關(guān)性，證實趨化因子誘導(dǎo)的T細(xì)胞對腸癌微環(huán)境的影響機(jī)制為T細(xì)胞誘導(dǎo)的結(jié)果。綜合本研究結(jié)果，考慮可重點關(guān)注CRC患者腸道微環(huán)境，根據(jù)既往研究可采用相關(guān)生物制劑或益生菌改善腸道微生態(tài)紊亂。另CRC組織中趨化因子表達(dá)水平可輔助判斷CRC患者腸道微生態(tài)變化。

綜上，微生物群可觸發(fā)CRC趨化因子產(chǎn)生，募集T細(xì)胞而改善預(yù)后，為臨床研究提供依據(jù)。但本研究受時間限制，收集病例數(shù)有限，有待擴(kuò)大樣本數(shù)進(jìn)一步研究。