文 歡，蔣 丹，南文斌,2，梁永書,2，張漢馬,2，秦小健,2*

(1.重慶師范大學生命科學學院，重慶 401331；2.重慶市植物環(huán)境適應分子生物學重點實驗室，重慶 401331)

【研究意義】水稻作為中國乃至世界上重要的糧食作物之一，類型豐富，具有悠久的栽培歷史[1-2]。除作為糧食外，在醫(yī)藥和工業(yè)等方面也發(fā)揮著重要作用，其穩(wěn)產與高產不僅對保證國家糧食安全具有重要意義，而且直接關系到全球社會的穩(wěn)定與發(fā)展[3-5]。在對糧食的需求量越來越大和耕地面積不斷減少的限制下，只能通過提高水稻單株產量來實現(xiàn)穩(wěn)產與高產從而保證糧食安全[6-7]。穗型是影響水稻增產的重要因素之一，因此研究長穗水稻材料的生理指標，發(fā)掘優(yōu)良的作物品種，從而為后續(xù)長穗突變材料的基因定位與克隆奠定了基礎，同時也為水稻增產研究奠定基礎。【前人研究進展】在耕地面積的限制下，想要保證水稻產量，除了雜種優(yōu)勢，最重要的就是通過株型來提高單株產量。株型在水稻的品質、產量、抗性和光能利用率上都有著重要作用，適當增加穗長、籽粒數(shù)量和提高結實率是實現(xiàn)水稻增產的主要途徑[8-9]。穗部不僅與群體的結構狀況和產量密切相關，是水稻高產育種和栽培的重點[10]，穗部在二氧化碳擴散、積累光合產物、改善群體光照狀況以及抗逆性方面占據(jù)重要地位[11]。近年研究也發(fā)現(xiàn)穗型對水稻產量起著決定性作用，與穗粒數(shù)、抽穗期、穗長等諸多水稻的性狀相關，而且直接決定稻穗分支的數(shù)量和長度，進而直接影響水穗的產量和品質[12-14]。其中穗長與穗數(shù)呈負相關，與株高、生長期呈顯著正相關[15]。穗長影響籽粒的排列，與稻米品質、每穗穎花數(shù)和病蟲害的發(fā)生都有很大的關系，因此開展水稻穗長的研究具有重要的理論意義和實踐基礎[16]。隨著分子和遺傳技術的發(fā)展，對穗長的研究不斷深入。誘變篩選長穗突變體，發(fā)現(xiàn)該突變體的株高顯著增高，穗長有不同程度的增長，在保留主要性狀的基礎上，有的性狀發(fā)生了有利變化[17]。對不同群體對數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus,QTL)的差異性以及不同環(huán)境下的水稻材料進行研究，越來越多與水稻穗長相關的QTL被定位和克隆[18-20]，已用于遺傳育種過程[21]。同時建立水稻分子輔助育種技術體系，運用分子生物學技術尋找與粒長相關的基因[22]。目前，穗型是提高水稻產量的重要研究內容，但有關水稻穗長性狀方面的研究仍然存在很多不足，相關基因還有待進一步挖掘和解析。【本研究切入點】本研究通過不同時期長穗材料與常規(guī)品種9311的生理指標進行測定和比較分析，進一步了解長穗材料的生理生化代謝特征。【擬解決的關鍵問題】此研究結果為后續(xù)穗長相關基因的進一步挖掘和研究奠定了基礎，并通過解析水稻穗長發(fā)育調控的分子機制為后續(xù)的育種實踐提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究實驗材料為前期EMS誘變獲得的水稻長穗突變材料和常規(guī)水稻品種9311。所有試驗均在重慶師范大學根系發(fā)育與氮高效利用實驗室進行。

1.2 相關生理生化指標測定

1.2.1 材料的獲取 長穗材料與對照材料9311于2019年4月初在重慶師范大學根系發(fā)育與氮高效利用重點實驗室試驗田進行播種并于5月初進行大田移栽。在苗期對長穗材料與常規(guī)水稻品種9311進行3次重復取樣,然后進行相關生理指標測定和分析。待其抽穗結實后以同樣方式取樣,并分析檢測其根、莖、葉的各項生理指標。

1.2.2 農藝性狀統(tǒng)計與分析 選取成熟后的長穗材料和9311的各3株且重復3次，分別統(tǒng)計其一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、千粒重、每穗粒數(shù)、結實率等性狀。數(shù)據(jù)利用Excel和Graphpad prism5進行相關分析。

1.2.3 SOD活性測定 用氮藍四唑(NBT)還原法測定SOD含量。將樣品在液氮中磨成漿后加入磷酸緩沖液，離心后加入NBT、甲硫氨酸溶液等進行顯色反應10～30 min，NBT被還原為藍色的甲腙，該物質在560 nm處有最大吸收。

1.2.4 葉綠素含量測定 用乙醇浸提法測定葉綠素含量，將莖葉剪碎后放于離心管中加入抽提液，4 ℃避光抽提12 h，再用酶標儀分別測定波長640 和663 nm下的吸光值。

1.2.5 脯氨酸含量測定 用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量，稱取0.3 g樣品加入5 mL 3 % 磺基水楊酸溶液沸水煮10 min，吸取2 mL提取液加入2 mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮沸水煮30 min,冷卻加入甲苯靜置后在波長為520 nm處比色，其色度與脯氨酸含量成正相關。

1.2.6 可溶性糖含量測定 用蒽酮比色法測定可溶糖含量，稱取0.3 g樣品剪碎后在沸水中煮10 min,冷卻后取2 mL加入蒽酮試劑，搖勻后沸水煮10 min，冷卻后在波長為620 nm處測其吸光度，色度與可溶性糖的含量成正比。

1.2.7 可溶性蛋白含量測定 用考馬斯亮藍G250法測定可溶蛋白含量，稱取0.3 g樣品，加水研磨后離心，取1 mL溶液加入5 mL考馬斯亮藍G250，該物質與可溶性蛋白結合后變?yōu)榍嗌?，?95 nm下有最大吸收值。

1.2.8 丙二醛含量測定 用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)法測定丙二醛含量，將樣品剪碎后加入5 mL 10 % 三氯乙酸研磨至勻漿，加入0.5 %TBA后沸水煮10 min，冷卻后用酶標儀測定波長在450、532、600 nm處的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)處理利用 Excel進行，相關性分析和作圖采用GraphPad Prism5和CorelDRAW X4來完成。

2 結果與分析

2.1 長穗材料相關農藝性狀統(tǒng)計分析

對長穗材料的相關農藝性狀進行統(tǒng)計分析，與常規(guī)水稻品種9311相比，發(fā)現(xiàn)其穗長、每穗粒數(shù)、二次枝梗數(shù)均有增加且達到差異顯著水平，而長穗材料的千粒重與9311相比顯著性降低。另外，長穗材料的結實率降低而單株產量方面有所增加但均為差異不顯著(圖1)。該材料作為一份優(yōu)異的水稻長穗種質資源,為后續(xù)水稻穗長相關基因定位克隆提供了材料基礎,同時為培育高產優(yōu)質的雜交水稻新品種提供了可能。

2.2 葉綠素含量分析

葉綠素作為光合作用反應過程的關鍵色素分子，其含量與植物光合作用效率及氮素營養(yǎng)密切相關，為植物的生長發(fā)育提供有機物。通常在一定條件下植物的產量與葉綠素含量呈正比,通過植物葉綠素含量測定對了解植物生長發(fā)育以及水稻育種十分重要。通過測定長穗材料與9311幼苗期和成熟期兩個時期的葉綠素含量，發(fā)現(xiàn)長穗材料幼苗期莖和成熟莖、葉中的含量顯著高于9311，而9311幼苗期葉中的含量顯著高于長穗材料，其中成熟期莖中的含量存在極顯著差異(圖2)。該結果表明隨著生長發(fā)育的進行,尤其在生長發(fā)育后期長穗材料可能具有更高的光合效率。

2.3 SOD和丙二醛含量測定

SOD作為一種抗氧化酶，在機體氧化與抗氧化平衡中起著重要的作用，而丙二醛含量可反應植物的抗逆性。分別測定長穗材料與9311幼苗期和成熟期的SOD和丙二醛(MDA)含量，分析發(fā)現(xiàn)MDA含量，9311幼苗期根和成熟期莖中的含量高于長穗材料，成熟期長穗材料葉中的含量明顯高于9311，其它無明顯差異，而在SOD活性方面，長穗材料幼苗期根和莖中的含量顯著高于9311，成熟期9311葉中的含量顯著高于長穗材料，其它無明顯差異(圖3)。從SOD和丙二醛測定的結果表明，與常規(guī)品種9311相比，長穗材料在幼苗期的抗逆性可能高于9311，而隨著生長發(fā)育進行到成熟期時其抗逆性可能相比較弱。

2.4 脯氨酸含量分析

脯氨酸作為植物蛋白的組成成分之一，其含量在一定程度上反應了植物的抗逆性。為了進一步分析與驗證長穗材料的抗逆特性，分別測定長穗材料和9311的幼苗期和成熟期兩個時期的脯氨酸含量，發(fā)現(xiàn)幼苗期的根和莖中脯氨酸含量存在顯著差異，均為長穗材料高于9311，而到成熟期時在根和葉中存在顯著差異，均為9311高于長穗材料(圖4)。結果表明，在不考慮其他因素的情況下，幼苗期的長穗材料抗逆性更強，到成熟期時其抗逆性與相比9311變弱，該結果與丙二醛和SOD的分析結果一致。

2.5 可溶糖與可溶蛋白含量測定

可溶糖是植物生長發(fā)育和基因表達調控過程的重要調節(jié)因子，在植物的整個生長周期中具有重要作用。為了解長穗材料不同發(fā)育階段的可溶性糖含量，分別在幼苗期和成熟期測定長穗材料與9311中的可溶性糖，結果顯示長穗材料的幼苗期葉和成熟期根、葉中的可溶糖含量均顯著高于9311，而9311成熟期莖中的含量高于長穗材料，其它無明顯區(qū)別(圖5-A和5-B)。另外，同時對2份材料的可溶性蛋白進行了測定，發(fā)現(xiàn)長穗材料幼苗期的根、莖、葉中均顯著低于9311，而成熟期的根中幾乎沒有檢測到可溶性蛋白，長穗材料的莖部含量明顯高于9311且葉部沒有明顯區(qū)別(圖5-C和5-D)。

2.6 長穗材料各生理生化指標的相關性

為進一步了解長穗材料在幼苗期和成熟期階段各生理生化指標的相互關系，對該材料在兩個階段不同生理指標進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，僅在長穗材料的幼苗期，莖部的脯氨酸含量和可溶糖含量呈極顯著的負相關，葉部的SOD含量與脯氨酸含量也存在極顯著的負相關性，其余指標存在的相關性均未達到顯著水平(表1)。另外，成熟期各相關指標間存在一定的相關性，但均未達到顯著水平(表2)。對不同部位在不同階段的各相關指標進行關聯(lián)分析，深入了解長穗材料在各生長發(fā)育階段的生理響應差異十分重要，同時也為后續(xù)進一步的研究工作提供一定幫助。

表1 長穗材料幼苗期生理指標相關性分析Table 1 Correlation analysis of physiological indexes in seedlings stage of long panicle rice

表2 長穗材料成熟期生理指標的相關性分析Table 2 Correlation analysis of physiological indexes in mature stage of long panicle rice

3 討 論

3.1 水稻穗型與產量的關系

水稻作為重要的糧食作物之一，如何提高或者保障水稻的產量成為當前水稻研究的重要內容之一[23]。在對糧食需求量不斷增加情況下，提高和保證水稻產量是目前育種的首要任務和目標。因此，創(chuàng)制和挖掘優(yōu)異的水稻種質資源，同時克隆和解析水稻產量關鍵基因對于保證國家糧食安全有十分重要的意義。已有研究表明，水稻穗長是一種受多基因控制數(shù)量性狀，易受環(huán)境的影響，同時對水稻產量產生直接影響[24]。賈寶艷等[25]認為水稻的質量和產量與穗部性狀是顯著的線性關系，研究穗部性狀，有利于找尋理想株型，提高水稻產量和質量[26]。胡繼鑫[27]研究遼寧地區(qū)不同水稻穗部性狀發(fā)現(xiàn)，適當增加穗長來提高產量。胡繼新[28]對水稻穗部研究表明，穗部性狀是產量結構重要組成部分，在不同的品種中差異較大。本研究中，針對長穗材料進行了相關農藝性狀分析，發(fā)現(xiàn)長穗材料與常規(guī)品種9311相比，穗長差異顯著，每穗粒數(shù)和二次枝梗數(shù)明顯較多，產量有所提高，說明穗部性狀與產量密切相關。

3.2 生理生化指標的測定與差異

根據(jù)之前研究表明丙二醛、SOD、脯氨酸、可溶糖和可溶蛋白與植物的抗逆性相關。戴高興等[29]以早稻品種瑰寶8號以及耐低鉀變異后代為材料模擬干旱脅迫，發(fā)現(xiàn)丙二醛、脯氨酸和SOD含量發(fā)生變化，表現(xiàn)為丙二醛、脯氨酸迅速上升，SOD先急劇上升后迅速下降。黃顯波等[30]在38 ℃高溫下以谷優(yōu)1292雜交秈稻為試驗材料，結果表明，隨著脅迫時間延長，丙二醛、脯氨酸含量逐漸上升，SOD活性逐漸減低。Saladin等[32]認為可溶性糖作為植物滲透調節(jié)的物質，其含量增加，有利于植物在干旱環(huán)境中生長。本研究中對獲得的長穗材料進行相關生理生化指標測定，長穗材料和9311相比，幼苗期的SOD、可溶糖、莖中的葉綠素和脯氨酸含量較高，成熟期的葉中的丙二醛、根中的可溶糖和葉綠素含量較高。表明在不同的發(fā)育時期植物體內各種物質的含量存在差異，其生理響應不同。與常規(guī)品種9311相比，長穗材料在幼苗期的抗逆性較好，但可能隨著生長發(fā)育的進行其抗逆性變弱。

3.3 各生理指標間的關系及長穗材料的后續(xù)研究

李佐同等[31]以抗病品種龍選9070、普粘7和感病品種麗江新團黑谷為材料，明確了可溶糖和可溶蛋白含量高有利于增強水稻對稻瘟病的抗性，說明可溶糖和可溶蛋白與水稻的抗病性相關。陳曉遠等[33]測定水分脅迫下水稻品種金優(yōu)402的可溶糖和游離脯氨酸的含量，發(fā)現(xiàn)隨時間延長，兩者的含量均上升。雷東陽等[34]用其雜交水稻及其恢復系為材料，研究水稻抽穗揚花期在高溫下對生理指標的影響，結果發(fā)現(xiàn)丙二醛和可溶糖含量均升高。何開躍等[35]通過測定不同低溫和冷凍處理的福建柏苗的可溶糖和丙二醛，結果兩者含量均上升。王娟等用玉米根系為材料模擬水分脅迫，發(fā)現(xiàn)SOD和MDA的含量呈極顯著負相關。本研究中筆者對丙二醛、SOD和脯氨酸等6項生理指標進行了相關性分析，對于長穗材料而言，幼苗期莖部的脯氨酸含量和可溶糖含量呈極顯著負相關，葉部的SOD含量和脯氨酸含量也存在極顯著的負相關性，表明在應對環(huán)境變化過程中，有多種物質相互作用共同參與調節(jié)生長發(fā)育與機體平衡。目前，正在構建長穗材料和9311的遺傳群體，為后續(xù)定位和克隆穗長相關基因奠定材料基礎，希望能進一步在分子水平揭示候選基因的調控功能，為水稻的分子育種奠定基礎，同時也為水稻高產品種的選育提供一定的支撐。

4 結 論

長穗材料穗長與常規(guī)品種9311相比差異顯著，具有每穗粒數(shù)、二次枝梗數(shù)多的優(yōu)點，在一定程度上提高了水稻產量。其次，長穗材料幼苗期的SOD酶活性、脯氨酸和可溶糖含量顯著高于9311，說明長穗材料在幼苗期時的抗逆性較好；但是長穗材料在成熟期階段的SOD酶活性和脯氨酸含量顯著低于9311，說明在生長發(fā)育后期其抗逆性不如9311，可能更易受環(huán)境因素的影響。另外，各指標間相關性分析表明，幼苗期莖部的脯氨酸含量和可溶糖含量呈顯著負相關，同時葉部的SOD含量和脯氨酸含量也存在極顯著的負相關性。