龔飄飄，蔡 亮，張炳東

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）是將患者體內(nèi)的血液引流到體外，經(jīng)過膜式氧合器進(jìn)行氣體交換，再通過泵的作用泵入體內(nèi)，使機(jī)體的氧合和血供維持相對的狀態(tài)，作為一種有效的持續(xù)支持血流動力學(xué)的工具和替代心肺循環(huán)的技術(shù)，在臨床上各個領(lǐng)域的應(yīng)用已引起廣泛重視[1]。目前在動物CPB實驗中，絕大多數(shù)的CPB預(yù)充液還是采用了體外全血，本實驗通過無血預(yù)充進(jìn)行CPB來模擬臨床，可以有效減少臨床用血。而術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是CPB術(shù)后一種常見的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者術(shù)后的生活質(zhì)量。星狀神經(jīng)節(jié)阻滯（stellate ganglion block，SGB）是通過局麻藥的擴(kuò)散和浸潤作用，引起由星狀神經(jīng)節(jié)支配區(qū)域的交感神經(jīng)受到抑制，SGB已用于各種疼痛治療、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、失血性休克導(dǎo)致功能障礙等[2-4]。無血預(yù)充下CPB 已成為目前動物研究的主要模型，POCD作為主要的并發(fā)癥，其發(fā)生率居高不下，降低POCD 發(fā)生率仍是急需解決的問題之一。因此，本實驗將SGB用于無血預(yù)充的CPB中，探討SGB在無血預(yù)充時對CPB術(shù)后POCD發(fā)生率的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 30 只健康SD 成年雄性大鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（許可證編號：SCXK 桂2014-0002），體重400～450 g。將大鼠隨機(jī)分為3 組：假手術(shù)組（S 組）、CPB 組（C 組）和SGB+CPB 組（SC 組），每組10 只。S 組大鼠只進(jìn)行動靜脈置管，C組大鼠建立CPB模型轉(zhuǎn)流2 h，SC組大鼠建立SGB后立即行CPB模型轉(zhuǎn)流2 h。

1.2 CPB 模型建立 腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg 將大鼠麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺上，行氣管插管，連接HX-300S 動物呼吸機(jī)（成都泰盟軟件有限公司），控制潮氣量為8 mL/kg，呼吸頻率為60次/min，維持呼氣末二氧化碳4.66～5.99 kPa 的機(jī)械通氣。CPB 采用右側(cè)頸外靜脈—右側(cè)股動脈。右側(cè)頸外靜脈用22G靜脈穿刺針置管引流，右側(cè)股動脈用24G靜脈穿刺針進(jìn)行灌注，尾動脈穿刺術(shù)監(jiān)測動脈血壓和血?dú)夥治觥ｌo脈給予400 IU/kg的肝素鈉，激活全血凝固時間（activated clotting time，ACT）≥480 s 后進(jìn)行CPB 轉(zhuǎn)流[5]。CPB 的預(yù)沖液為6 mL 羥乙基淀粉、4 mL乳酸林格氏液、0.5 mL 5%NaHCO、0.5 mL 呋塞米和1 mL 20%甘露醇。整個體外預(yù)充管道通過Stockert Ⅲ雙頭滾壓泵（德國Stockert 公司）和小動物膜肺（東莞科威醫(yī)療器械有限公司），CPB轉(zhuǎn)流2 h后用1∶1的魚精蛋白拮抗肝素。

1.3 SGB 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg，在仰臥位的狀態(tài)下行SGB。在大鼠左側(cè)胸鎖關(guān)節(jié)外側(cè)0.3 cm 處注射0.1 mL 1%利多卡因進(jìn)行局麻，用1 mL注射器垂直進(jìn)針穿刺，針尖斜面朝上，朝向足端約0.3 cm 時注射0.25%羅哌卡因0.5 mL+1%利多卡因0.5 mL。SGB 成功的標(biāo)志為出現(xiàn)明顯Horner 綜合征，表現(xiàn)為大鼠左側(cè)眼窩內(nèi)陷、瞳孔縮小、眼瞼下垂和眼裂變小。SGB成功后進(jìn)行CPB模型建立。

1.4 血液生化指標(biāo)檢測 分別于實驗開始前（T0）和實驗開始后1 h（T1）、2 h（T2）、6 h（T3）、24 h（T4）、72 h（T5）、第7 天（T6）抽取大鼠尾動脈血0.4 mL，用i-STAT1 血?dú)夥治鰞x（美國Medtroniz 公司）測量酸堿（pH）值、鈉離子（Na+）、鉀離子（K+）、游離鈣離子（iCa2+）、血紅蛋白（Hb）和血糖（Glu）濃度。

1.5 血漿白介素-2（IL-2）含量檢測 將大鼠麻醉后，在右頸內(nèi)靜脈處取血0.8 mL，置于抗凝管中，4 ℃下1 000 r/min 離心10 min，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測T0～T6 時間點各組大鼠血漿中IL-2 的含量。試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 蘇木精－伊紅（HE）染色檢測 將各組大鼠麻醉后斷頸取腦，用組織固定液固定24 h 后修塊，階梯式脫水，石蠟包埋，冠狀位切片，厚約5 μm。HE依次染色，脫水封片，光學(xué)顯微鏡觀察大鼠海馬的組織結(jié)構(gòu)。

1.7 尼氏染色檢測 將各組大鼠腦組織的石蠟切片脫蠟后用甲苯胺藍(lán)染色，冰醋酸分化，脫水透明封片，顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)特征。

1.8 術(shù)后認(rèn)知功能檢測 將T4～T6 時間段的各組大鼠放入水迷宮中進(jìn)行測試。測試開始前讓大鼠在水中自由游泳2 min，找到水中平臺，若大鼠未及時找到平臺，則引導(dǎo)大鼠找到平臺[6]。正式測試時間為90 s，大鼠隨機(jī)從4個象限進(jìn)入水池，找到平臺后休息2 min，再進(jìn)入下一個象限測試，記錄大鼠的運(yùn)動軌跡、各象限的穿越次數(shù)和潛伏期時間。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間段各組大鼠血液生化指標(biāo)比較 與S組相比，C組和SC組在T2～T3時間段的pH值、Na+、K+的濃度和Glu 濃度明顯升高，iCa2+濃度明顯下降。在T2 時間段，三組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；在T3 時間段，與S 組比較，C 組的pH 值、Na+、K+、Glu 的濃度升高且iCa2+的濃度降低（P＜0.05），SC 組的Na+濃度升高且iCa2+濃度降低（P＜0.05），與C組相比，SC組的pH值、Na+、K+、Glu濃度降低且iCa2+的濃度升高（P＜0.05），見表1。

2.2 不同時間段各組大鼠Hb含量比較 C組和SC組在T2～T5 時間段的Hb 的含量低于S 組，且在T2時間段最低（均P＜0.05）。在T2～T4 時間段，C 組Hb 含量低于SC 組，且均低于S 組（P＜0.05）；在T5時間段，C 組和SC 組Hb 含量低于S 組（P＜0.05），見表2。

表1 不同時間段各組大鼠血液生化指標(biāo)比較

表1 不同時間段各組大鼠血液生化指標(biāo)比較

與S組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05。

表2 不同時間段各組大鼠Hb含量比較g/dL，

表2 不同時間段各組大鼠Hb含量比較g/dL，

與S組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05。

2.3 不同時間段各組大鼠血漿IL-2濃度比較C 組和SC 組的IL-2 濃度在T2～T4 時間段高于S 組（均P＜0.05），且在T2 時間段最高。在T2～T4時間段C組IL-2濃度高于SC組，且均高于S組（P＜0.05），見圖1。

圖1 不同時間段各組大鼠血漿IL-2濃度

2.4 大鼠海馬組織病理學(xué)改變 HE染色觀察，S組DG 區(qū)的大鼠海馬細(xì)胞排列緊密而整齊；而C 組大鼠海馬組織受損嚴(yán)重，細(xì)胞排列紊亂疏松、神經(jīng)元彌漫性空泡變性、大量小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤、核固縮明顯；SC 組的病理學(xué)改變較C 組明顯緩解，細(xì)胞排列較為規(guī)則，小膠質(zhì)細(xì)胞、核固縮細(xì)胞和神經(jīng)元空泡變性的數(shù)量也明顯減少，見圖2。

2.5 大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變 尼氏染色觀察，S 組的大鼠海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元排列緊密且層次清晰、結(jié)構(gòu)完整且神經(jīng)元中尼氏小體含量豐富；而C組神經(jīng)元帶不完整、神經(jīng)元缺失嚴(yán)重，且尼氏小體解體明顯；SC 組神經(jīng)元受損情況較C 組明顯好轉(zhuǎn)，神經(jīng)元排列相對規(guī)整，神經(jīng)元缺失數(shù)量減少，且尼氏小體含量相對豐富，見圖3。

2.6 不同時間段各組大鼠水迷宮運(yùn)動數(shù)據(jù) 在T4～T6時間段，C組比SC組大鼠在空間探索中象限穿越次數(shù)增加，逃避潛伏期時間延長，且兩組數(shù)值明顯高于S組（均P＜0.05），見圖4。

圖2 大鼠大腦組織切片HE染色（×200）

圖3 大腦海馬組織切片尼氏染色（×400）

圖4 不同時間段各組大鼠象限穿越次數(shù)和潛伏期

3 討論

Na+和K+是維持細(xì)胞膜穩(wěn)定的重要因素,血液中Na+和K+的濃度直接到影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。有研究表明Na+-K+-ATP 酶，鈣活化性K+通道活性增加，可以有效維持血管內(nèi)皮平滑肌的舒張[7-8]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號驅(qū)動內(nèi)皮集落形成細(xì)胞增殖、遷移、歸巢和新血管形成，可以有效維持突觸的結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)傳遞[9-10]。本研究結(jié)果顯示，SC 組中Na+、K+、Glu濃度和Hb含量低于C組，高于S組；SC組中iCa2+高于C 組，低于S 組（P＜0.05）。因此，SGB 可有效減少無血預(yù)充CPB造成高鉀、高鈉、高糖、低鈣導(dǎo)致的不良反應(yīng)，有效阻滯痛覺神經(jīng)的傳導(dǎo)和血管的運(yùn)動，緩解肌肉緊張；中樞作用可通過下丘腦的調(diào)節(jié)維持機(jī)體正常的免疫功能、內(nèi)分泌功能和植物神經(jīng)功能，維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，加快機(jī)體修復(fù)[11-13]。

IL-2 作為有效的抗炎因子，主要來源于CD 輔助T 細(xì)胞下，從而持續(xù)低水平狀態(tài)。在無血預(yù)充的CPB 中，可能反復(fù)激活了Prdm1 編碼的轉(zhuǎn)錄因子B淋巴細(xì)胞激活，誘導(dǎo)成熟蛋白1 抑制IL-2 的大量產(chǎn)生[14]。本研究結(jié)果顯示，SC 組IL-2 濃度高于S 組，低于C組（P＜0.05），反映C組炎癥因子的濃度高于SC組，高于C組，說明SGB可以通過激活部分免疫細(xì)胞，如T 細(xì)胞受體、自然殺傷細(xì)胞，自然殺傷T 細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞大量分泌IL-2，使體內(nèi)IL-2的濃度迅速增加，從而抑制炎癥因子的產(chǎn)生[15]。

在CPB中，無論是缺血還是炎癥均會引起細(xì)胞水腫進(jìn)而導(dǎo)致腦水腫，最先體現(xiàn)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，表現(xiàn)為空泡樣變性。在CPB 中會增加反應(yīng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的血管內(nèi)皮生長因子，從而會破壞血腦屏障，并加速星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，而無血預(yù)充下的CPB 會使其進(jìn)一步加劇，加重腦水腫[16]。小膠質(zhì)細(xì)胞可誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)，也是產(chǎn)生炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)，過度激活引起神經(jīng)元損傷，其活化程度與腦組織的損傷程度密切有關(guān)[17]。尼氏小體一般分布于神經(jīng)元的樹突和胞質(zhì)內(nèi)，作為神經(jīng)細(xì)胞特有的結(jié)構(gòu)，會隨神經(jīng)元的損傷而減少或溶解[18]。本研究結(jié)果顯示，SC組細(xì)胞的排列、神經(jīng)元空泡樣變性以及小膠質(zhì)細(xì)胞的活化數(shù)量明顯少于C 組，且尼氏小體含量明顯多于C 組。說明SGB可以改善CPB導(dǎo)致的大腦水腫，減少神經(jīng)炎癥，緩解缺血缺氧的情況。

有研究表明，Morris 水迷宮廣泛用于空間記憶和學(xué)習(xí)，可作為術(shù)后認(rèn)知功能的檢測實驗，但運(yùn)動功能缺陷不能作為水迷宮認(rèn)知功能測定的混淆因素[6]。本研究結(jié)果顯示，C組平均潛伏期長于SC組，象限穿越次數(shù)多于SC組（P＜0.05），邊緣活動增多，中央活動減少，說明大鼠的空間記憶能力下降。表明SGB可以減少CPB引起的POCD。

研究顯示，在無血預(yù)充的情況下進(jìn)行CPB容易加重機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂，導(dǎo)致組織、器官缺血缺氧壞死，如外周末梢功能循環(huán)障礙、認(rèn)知功能障礙、延長術(shù)后恢復(fù)時間甚至實驗動物死亡[19-21]。然而因血源緊張、用血困難，在無血預(yù)充下進(jìn)行CPB 是不可避免的臨床問題。而SGB 可以有效減少無血預(yù)充下進(jìn)行CPB帶來的不良反應(yīng)，從而對大鼠產(chǎn)生保護(hù)作用，減少POCD的發(fā)生率。

綜上所述，SGB可以在一定程度上穩(wěn)定大鼠在無血預(yù)充條件下進(jìn)行CPB時機(jī)體的內(nèi)環(huán)境，調(diào)控血漿中IL-2的表達(dá)，減輕大腦的組織細(xì)胞水腫和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，改善大腦缺血缺氧的狀況，從而減少大鼠POCD的發(fā)生。