任冰潔，楊媛媛，卞徐宇，李 強(qiáng),2，梁容瑞，陶 敏△

（1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，蘇州 215006 ；2.江西省腫瘤醫(yī)院淋巴血液腫瘤科，南昌 330029）

肺癌是一種高發(fā)惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占絕大多數(shù)。NSCLC 可分為肺腺癌（LUAD）、肺鱗癌（LUSC）和大細(xì)胞癌，其中LUAD是最常見的亞型。LUAD早期無明顯癥狀不易被發(fā)現(xiàn)，5年生存率不足30%[1]。肺癌的形成是一個(gè)多階段和多因素參與的復(fù)雜過程。

高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是高遷移率族蛋白家族的成員，在哺乳動物細(xì)胞中廣泛表達(dá)。HMGB1 具有細(xì)胞內(nèi)活性和分泌活性，細(xì)胞內(nèi)的HMGB1 能與DNA 結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄過程中起關(guān)鍵作用。分泌到細(xì)胞外的HMGB1 可與Toll 樣受體（TLRs）和晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合，激活下游信號通路參與腫瘤的發(fā)生、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1 過表達(dá)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并與患者預(yù)后不良有關(guān)[2]。在肺癌方面，雖然有研究表明HMGB1 與LUAD 的不良預(yù)后有關(guān)，但HMGB1參與LUAD的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在探討可能參與LUAD 發(fā)生發(fā)展的HMGB1下游關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

1 方 法

1.1 HMGB1 相關(guān)基因分析 UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個(gè)交互式門戶網(wǎng)站，用于深入分析TCGA 中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)[3]。為了獲取LUAD 中與HMGB1 表達(dá)相關(guān)的基因，本研究從UALCAN數(shù)據(jù)庫TCGA analysis板塊下的Correlation 中獲取了與HMGB1 表達(dá)相關(guān)基因的數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel 中，設(shè)置皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearson-CC）≥0.4，篩選相關(guān)基因。

1.2 生存分析 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫TCGA analysis 板塊對UALCAN 數(shù)據(jù)庫篩選出的基因分別做生存分析，篩選具有生存意義的基因[3]。

1.3 蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用分析 STRING（https://string-db.org）數(shù)據(jù)庫是一個(gè)在線搜索已知蛋白，以及預(yù)測蛋白質(zhì)互作關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，包括蛋白質(zhì)之間直接物理相互作用，及間接功能的相關(guān)性[4]。將TCGA 篩選出的基因和HMGB1 基因一起輸入STRING 數(shù)據(jù)庫中，建立蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測 AnimalTFDB3.0（http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/）是一個(gè)提供動物轉(zhuǎn)錄因子（TFs）及其輔助因子信息資源的數(shù)據(jù)庫，包含來自97 個(gè)動物基因組的125 135 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和80 060 個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助因子基因[5]。JASPAR（http://jaspar.genereg.net/）是一個(gè)提供轉(zhuǎn)錄因子與DNA 結(jié)合位點(diǎn)以及結(jié)合模式的公共數(shù)據(jù)庫[6]。首先，通過NCBI 的Gene 模塊查找目標(biāo)基因，計(jì)算目標(biāo)基因啟動子區(qū)域，一般認(rèn)為基因起點(diǎn)上游2 000 bp及下游100 bp為基因潛在啟動子區(qū)域。其次，在AnimalTFDB3.0 的Predict TFBS 功能預(yù)測欄輸入目標(biāo)基因的啟動子序列，在預(yù)測結(jié)果欄可以得到與目標(biāo)基因結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。最后，挑選潛在的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，利用JASPAR 數(shù)據(jù)庫預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子在目標(biāo)基因啟動子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)。

1.5 信號通路分析 京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）（https://www.kegg.jp/kegg）是一個(gè)綜合性的網(wǎng)站，是最為知名和通用的信號通路數(shù)據(jù)庫[7]。通過KEGG中的KEGG GENES 功能來分析相關(guān)的信號通路及通路下游轉(zhuǎn)錄因子。

2 結(jié)果

2.1 LUAD 中與HMGB1 相關(guān)的基因 UALCAN[3]數(shù)據(jù)庫分析LUAD 中與HMGB1 表達(dá)相關(guān)的基因，得到正相關(guān)基因528 個(gè)，其中皮爾遜相關(guān)系數(shù)≥0.4的基因有101個(gè)，負(fù)相關(guān)基因2個(gè)，其中皮爾遜相關(guān)系數(shù)≥0.4的基因?yàn)?個(gè)。篩選出的101個(gè)皮爾遜相關(guān)系數(shù)≥0.4的正相關(guān)基因見表1。

2.2 生存分析和蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析顯示，33個(gè)基因與LUAD的生存預(yù)后有關(guān)[3]，LUAD 組織中細(xì)胞周期蛋白依賴激酶1（CDK1）、H2A 組蛋白家族成員Z（H2AFZ）表達(dá)量明顯高于正常肺組織，且CDK1、H2AFZ 低/中表達(dá)組患者生存時(shí)間明顯長于CDK1 和H2AFZ 高表達(dá)組（均P＜0.05），見圖1。STRING數(shù)據(jù)庫分析顯示，CDK1和H2AFZ基因與HMGB1存在相互作用[4]，見圖2。

表1 LUAD中與HMGB1相關(guān)的基因

圖1 LUAD組織CDK1和H2AFZ的表達(dá)及生存曲線

圖2 蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用

2.3 CDK1 的轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測 首先通過NCBI 數(shù)據(jù)庫查找CDK1 基因的啟動子序列。然后利用AnimalTFDB3.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測CDK1基因的轉(zhuǎn)錄因子[5]，獲得572 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。其中SOX2 和SP1是CDK1 的轉(zhuǎn)錄因子[8-9]。因此選擇SOX2 和SP1 進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測。最后利用JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測SOX2 和SP1 轉(zhuǎn)錄因子在CDK1 啟動子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)[6]，見圖3。

2.4 H2AFZ 的轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測 首先通過NCBI 數(shù)據(jù)庫查找H2AFZ 基因的啟動子序列。然后利用AnimalTFDB3.0 數(shù)據(jù)庫預(yù)測H2AFZ 基因的轉(zhuǎn)錄因子[5]，獲得598 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。SOX2 和SP1是H2AFZ 的轉(zhuǎn)錄因子[10-11]，因此，選擇SOX2 和SP1進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測。最后利用JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測SOX2 和SP1 轉(zhuǎn)錄因子在H2AFZ 啟動子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)[6]，見圖4。

2.5 SOX2的上游調(diào)節(jié)基因 有研究表明，HMGB1可以通過PI3K/Akt 和ERK 信號通路促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[12]。為了分析Akt和ERK是否對SOX2有調(diào)節(jié)作用，本研究利用KEGG 數(shù)據(jù)庫查找相應(yīng)的信號通路[7]。如圖5 所示，當(dāng)Akt 或ERK 被上游信號激活后，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中來促進(jìn)SOX2的轉(zhuǎn)錄。

圖3 SOX2-motif和SP1-motif在CDK1啟動子區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)

圖4 SOX2-motif和SP1-motif在H2AFZ啟動子區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)

圖5 Akt和ERK相關(guān)信號通路圖

3 討論

肺癌是世界上最常見和最致命的癌癥之一。隨著診療水平的不斷提高，肺癌患者的生存期大大延長。然而，肺癌患者的5年復(fù)發(fā)率卻很高，復(fù)發(fā)患者的治療選擇有限[13]。肺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，HMGB1 可能參與了肺癌發(fā)展的多個(gè)階段。研究表明，HMGB1可能參與了肺癌的發(fā)展，且LUAD患者的生存呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[14]。

HMGB1 是一種高度保守的蛋白質(zhì)，與多種惡性腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）和Toll樣受體家族（如TLR-2、TLR-4、TLR-9）是HMGB1 的重要受體。越來越多的研究表明，HMGB1與RAGE或TLRs結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞活化，從而延長炎癥、增殖和凋亡的持續(xù)時(shí)間[15]。HMGB1 結(jié)合RAGE 或TLRs 可以激活細(xì)胞內(nèi)信號通路PI3K/Akt 和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK、ERK1/2)來調(diào)節(jié)NCSLC 的活化和增殖[16]。本研究分析LUAD 中與HMGB1 表達(dá)相關(guān)的基因，篩選出101 個(gè)高度正相關(guān)的基因。利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析這101 個(gè)高度正相關(guān)基因的表達(dá)與LUAD 之間的生存相關(guān)性。結(jié)果顯示，33 個(gè)基因與LUAD 的生存預(yù)后有關(guān)。通過STRING數(shù)據(jù)庫建立HMGB1與這33個(gè)基因的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)CDK1和H2AFZ與HMGB1之間存在相互作用。

CDK1 基因編碼的蛋白質(zhì)是Ser/Thr 蛋白激酶家族的成員。該蛋白是高度保守的蛋白激酶復(fù)合物M 期啟動因子(MPF)的催化亞基，在真核細(xì)胞周期的G1/S和G2/M中起關(guān)鍵作用。在癌癥中經(jīng)常觀察到CDK1活性的失調(diào)。通過整合來自不同數(shù)據(jù)庫(TCGA 和GEO)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，鑒定了CDK1 在LUAD 中的表達(dá)上調(diào)。據(jù)報(bào)道，CDK1 上調(diào)與LUAD 的不良預(yù)后有關(guān)[17]。H2AFZ 是組蛋白H2A的變體，在酵母及哺乳動物細(xì)胞具體保守序列。H2AFZ在基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期進(jìn)程和基因組穩(wěn)定性維持過程中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明，H2AFZ 的過表達(dá)是肝細(xì)胞癌、乳腺癌預(yù)后不良的一個(gè)指標(biāo)[18]。本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)H2AFZ在LUAD中表達(dá)上調(diào)，且高表達(dá)與LUAD的不良預(yù)后有關(guān)。

PI3K/Akt 已被證明在細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。PI3K/Akt 可以激活細(xì)胞周期蛋白D，抑制CDK 抑制劑p21 活性，從而促進(jìn)G1/S 期轉(zhuǎn)變。另外，PI3K/Akt 失活將導(dǎo)致G1 期阻滯[19]?？偟膩碚f，PI3K/Akt可以通過抑制P21的活性來促進(jìn)CDK1的表達(dá)，參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)[20]。另外，ERK 信號通路可以上調(diào)CDK1，增加G2/M期細(xì)胞比例[21]。有研究表明，Akt 是SOX2 表達(dá)的上游調(diào)節(jié)因子，抑制Akt 通路可以降低食管鱗狀細(xì)胞中SOX2 的表達(dá)[22]。Chen 等[23]證實(shí)，澳洲茄邊堿可以抑制Akt 信號傳導(dǎo)，降低SP1和p65的表達(dá)，從而抑制人肺癌細(xì)胞的生長。ERK 通路也是HMGB1 的重要下游通路，有研究表明FGFR1可以通過MAPK信號通路調(diào)節(jié)SOX2 的表達(dá)，F(xiàn)GFR1-ERK1/2-SOX2 軸可促進(jìn)FGFR1擴(kuò)增肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[24]。SP1是ERK的下游信號分子已通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[25]。本組利用生物學(xué)信息技術(shù)預(yù)測CDK1和H2AFZ的轉(zhuǎn)錄因子，預(yù)測到的轉(zhuǎn)錄因子包括SOX2 和SP1。SOX2 和SP1 轉(zhuǎn)錄因子已被證明可以調(diào)節(jié)CDK1 和H2AFZ 的轉(zhuǎn)錄[8-11]。

本研究表明，HMGB1 可能是通過PI3K/Akt 或ERK 信號通路促進(jìn)SOX2 或SP1 表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)CDK1或H2AFZ基因，參與LUAD的進(jìn)展。